用Indo-1检测钙离子流动

niwanmao

Indo-1通过UV激发，故需配备UV激光器的流式细胞仪。

• 将1管 (50 µg indo-1)溶解于50 µl DMSO，制成1mM的溶液。检测T和B细胞时用1 mM indo-1；检测粒细胞和单核细胞时用1-3 mM；检测树突状细胞时用3-6 mM Indo-1。标本中的细胞密度应为1-10 x 106/ml.
• 37°C孵育45-60分（水浴或孵箱均可）。用无血清的培养基或PBS洗涤两次，再用PBS或无血清培养基重悬（细胞密度106/ml左右）。如果马上进行检测，请保持细胞在37℃。如果要以后进行检测，请将标本置于冰上，但在检测之前一定要恢复至室温或37℃，因为Indo-1的荧光强度是依赖于温度的。
• 如果需要进行免疫表型标记，请在冰上进行染色。
• 细胞可在具备六色分析功能的BD LSR上检测。这样，FITC、PE、TC和APC可用于免疫表型标记。Info-1只会进入活细胞内，所以不需要用PI排除死细胞。
• BD LSR的条件设置。钙离子结合的Indo-1：紫外光FL-5 424/44 nm BF filter；未结合钙离子的Indo-1：绿光 FL-4 530/30nm BF filter。钙离子流动可通过钙离子结合Indo-1和未结合钙离子Indo-1之间的比例来衡量，或用FL-5/FL-4与时间的比例。（图见）
• Full scale deflection of the calcium flux is measured by the addition of ionomycin 1-10 mg/ml.  Contribution of internal stores of calcium can be measured by resuspending cells in calcium-free medium and then adding ionomycin.
  

laoyeche

请问倪老师，用FlowJo分析的时候横坐标是时间，纵坐标有的文献是0.5,1.0…有的文献是300,600……为什么会不一样，这代表着什么呢？我用BD Arial 2做的Indo-1, anti-CD3+anti-CD28刺激正常PBMC，没有Ca流的增加，这可能是什么原因呢？用Fluo-3am标记，横坐标时间，这种检测方法国际承不承认呢？问题有点多，期待您的回答。谢谢！

niwanmao

laoyeche 发表于 2015-1-5 08:52
请问倪老师，用FlowJo分析的时候横坐标是时间，纵坐标有的文献是0.5,1.0…有的文献是300,600……为什么会不 ...

A flow cytometric comparison of Indo-1 to fluo-3 and Fura Red excited with low power lasers for detecting Ca(2+) flux.这篇文章应该对你有帮助。
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzMyMXw0NjI5NTA3ZXwxNzQzNDQ0Njc2fDB8

laoyeche

您好倪老师，为什么我用anti-CD3+anti-CD28刺激不起来呢，用离子霉素做了阳性对照是没问题的。

niwanmao

laoyeche 发表于 2015-1-5 21:28
您好倪老师，为什么我用anti-CD3+anti-CD28刺激不起来呢，用离子霉素做了阳性对照是没问题的。 ...

你的意思是两个组，一个组用CD3、CD28刺激，没有钙流，另一组用离子霉素刺激，可测到？
那么会不会是CD3的问题？

laoyeche

niwanmao 发表于 2015-1-6 08:47
你的意思是两个组，一个组用CD3、CD28刺激，没有钙流，另一组用离子霉素刺激，可测到？
那么会不会是CD3 ...

CD3之前用来刺激过细胞测细胞因子，没发现异常

niwanmao

laoyeche 发表于 2015-1-6 09:05
CD3之前用来刺激过细胞测细胞因子，没发现异常

传两个数据文件上来吧，分析分析看。

laoyeche

您好，这是我这次做的结果

niwanmao

laoyeche 发表于 2015-1-6 09:16
您好，这是我这次做的结果

原始数据文件有吗？中间没连续测？

laoyeche

中间间断的是加刺激剂的时间。我做了Fluo3am和Indo-1两种，分别用Calibur和Aria2 BD。原始文件在附件里。