关于用modfit分析凋亡的疑问

nrq4123

我用的PI单染，测细胞凋亡率。数据用modfit分析的。

分析的过程，我有个疑惑。因为我的Sub-G1峰不是特别明显，所以确定Apop门的时候，拿不准。Apop门比较靠左，fit 功能之前，呈现的Apoptosis蓝色模拟门靠左。随着Apop门的移动，Apoptosis蓝色模拟门也会移动。而且当Apoptosis蓝色模拟门在左、中、右时，fit功能后，分析出来的Apoptosis百分比差距比较大。
图的顺序分别为：靠左边时；靠中间时；靠右边时。
所以分析的时候，具体是怎么确定Apop门的位置的呢？

niwanmao

你的拟合结果应该是这样的才对啊。凋亡应该很少很少。

nrq4123

niwanmao 发表于 2013-9-30 22:48

                               
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你的拟合结果应该是这样的才对啊。凋亡应该很少很少。

我开始圈细胞没圈好。
那倪老师，G1/G2不是尽量使它的比值接近2吗？而且我按照您这个圈细胞的方法，和G1、G2划门的方法，再去移动Apop门，那个蓝色的模拟门还是会左右移动。请问您具体分析的时候，是如何确定Apop门的位置的呢？

我的实验是乙醇固定，PBS*2，之后，用（PI+曲拉通）的工作液染色，上机测试。师姐说，有可能是因为我的工作液没有加破膜剂，而导致的sub-g1和g1没有分开，粘连到一起了；   也有可能是我的样品细胞凋亡的太少，想请教下倪老师的意见。

niwanmao

nrq4123 发表于 2013-10-1 10:17

                               
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我开始圈细胞没圈好。
那倪老师，G1/G2不是尽量使它的比值接近2吗？而且我按照您这个圈细胞的方法，和G1 ...

细胞周期就是用Triton破膜，所以不存在没破膜的说法。
可能还是乙醇固定这一步上，尝试一下将细胞产入乙醇溶液中，找一下站内相关资料。

至于拟合的时候G2/G1的比例，如果你获取细胞的时候G1峰位置放的合适，他们的比例是会接近2 ，但是如果G1的荧光道数偏小，那么他们就会小于2，G2/G1的比例1.5～2.5都是可以的。
凋亡细胞的门放在G1前即可，没有特别要求，关键是峰的拟合要正确反映真实峰的分布。

nrq4123

niwanmao 发表于 2013-10-1 11:08

                               
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细胞周期就是用Triton破膜，所以不存在没破膜的说法。
可能还是乙醇固定这一步上，尝试一下将细胞产入乙 ...

非常感谢倪老师的回复，我想再请问下“峰的拟合要正确反映真实峰的分布”这句话的意思是，拟合出来的峰形  要尽量接近   我拟合之前的线条峰形  是吧？！

乙醇固定这步，站内的资料我查过蛮多。我是细胞悬液加到无水乙醇里面，但是是1.5ml的EP管，我很难做到边加边震荡，晃不起来液体。

获取细胞的时候，FL3的电压调节，是不仅只看 FS/SS和FL3/AUX的圈细胞，还要看G1峰和G2峰的位置关系吗？~

感谢老师国庆节还在帮我解答

niwanmao

nrq4123 发表于 2013-10-1 12:38

                               
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非常感谢倪老师的回复，我想再请问下“峰的拟合要正确反映真实峰的分布”这句话的意思是，拟合出来的峰形 ...

是的，拟合的曲线尽量跟真实峰的分布接近。

乙醇固定不要用1.5ml的EP管，用大的falcon管。否则你是震荡不均匀的。

获取细胞的时候FL3电压调节就是调节G1、G2的间距，当你在geomean上看出两个峰之间接近2的比例时，就可以了。

nrq4123

niwanmao 发表于 2013-10-1 15:30

                               
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是的，拟合的曲线尽量跟真实峰的分布接近。

乙醇固定不要用1.5ml的EP管，用大的falcon管。否则你是震荡不 ...

我们的仪器是贝克曼的，也不知道，有没有geomean这个指标，下次看看吧。

倪老师的回复给了我非常大的帮助，我会尽快重做这个实验。到时如果还有问题，再来请教老师！

niwanmao

nrq4123 发表于 2013-10-2 11:10

                               
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我们的仪器是贝克曼的，也不知道，有没有geomean这个指标，下次看看吧。

倪老师的回复给了我非常大的帮 ...

没有geomean就看其它荧光平均值的参数即可。

nrq4123

niwanmao 发表于 2013-10-2 11:12

                               
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没有geomean就看其它荧光平均值的参数即可。

倪老师，我又做了一批样品，用modfit分析的时候我发现，我放那些G1、G2峰的时候，出现的峰形比较接近我的真实峰形。但是，点了FIT之后，就和之前放峰时拟合的线性不一样，感觉和真实峰没那么像了。
那这种情况，我应该用fit之前的模拟峰形，还是fit之后的模拟峰形来判断，我的拟合算不算和真实峰接近呢？

niwanmao

nrq4123 发表于 2013-10-24 10:33

                               
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倪老师，我又做了一批样品，用modfit分析的时候我发现，我放那些G1、G2峰的时候，出现的峰形比较接近我的 ...

apoptosis峰的位置不对，应该是尽量靠近G1峰，你现在放的位置应该是碎片位置。
在放峰的位置时，只是定位用，最后拟合的结果我觉得这两个都不对，所以你一方面要调位置，另一方面要调节模型中的G2/G1的ratio比值，从你这两个图看，我觉得你把ratio值设置为1.7比较合适。