用PI检测细胞周期

niwanmao

标题：用PI检测细胞周期

1. 收集细胞，制备单细胞悬液。
2. 300g离心5分钟洗涤细胞，重复2次。用PBS重悬细胞（细胞密度3-6 x 10⁶ cells/ml）。
3. 取500µl细胞至15ml 的试管中，以边加边振荡的方式加入5ml 70\%冰乙醇。
   如果加入乙醇时不振荡，细胞会立即成团，对日后的标本处理有影响。
4. 细胞至少在4°C固定1小时。
   在－20°C环境下，细胞在70\%乙醇中可保存数月。
5. 以300g或稍高的速度用PBS洗涤两次。
6. 加入500µl的PI染液，4°C孵育3小时。
7. 上机获取数据，分析。

所需试剂：

1. PI储存液（1mg/ml）
   溶解1mg Propidium Iodide (Sigma # P 4170)于1ml蒸馏水中，避光保存在4ºC。
2. RNase A (DNase free) 储存液， 2mg/ml
   溶解2mg RNase A (sigma # R 6513) 于1ml 蒸馏水中。保存于4ºC。
3. PI染色液(1X PBS, 2\%FBS, 50µg/ml PI, 200µg/ml RNase A,  .1\% Igepal )
   配制方法：
   准备9.5ml 1XPBS w/ 2\%FBS，并加入
   1)    500µl PI 储存液 (1mg/ml)
   2)    10µl RNase A储存液
   3)    10µl Igepal (Sigma # CA-630，用于替代NP40)

回答者：plane

有几个问题想请教一下

加入70\%乙醇固定时，实验室师兄说先加30\%体积的预冷的PBS吹打均匀，然后边振荡边慢慢加入100\%预冷的无水乙醇。请问哪种方法会好点？

对于RNase A有相关文献说是要另外配制，在上机检测前加入，也有文献说配制PI染液的时候一起混合配制即可，请问哪样做会好点？

另外，关于PI染色液的配方，不同的文献也有些不同。如：0.1\%sodium citrate,20μg/ml RNase,0.3\% Nonidet P40 and 50μg/m Propidium iodide.(Xavier Lery,1999) 。请问，为什么要加入FBS啊，文献中为何是加0.1\%sodium citrate。

2009年8月12日 0:54

回答者：niwanmao

1、不能这样加乙醇，先配成70％的冰乙醇，然后边振荡边加。

2、我们平时是用RNA酶配好PI染液，用时直接用。当然，储存时间不能过长。最好少量配，1个月内用完。

3、PI染液的配方是有差别的，这很正常。象0.1％的柠檬酸钠、FBS都是用来辅助用的，可加可不加的。但是PI、RNAse、破膜剂（NP40或Triton X-100）都是必需的。

2009年8月12日 0:54

回答者：heihei2866

我想请教一下，PI染液的配方为50 ug/ml PI, 1.0\% Triton X-100, 0.1 mol/L EDTA(Na)₂, 50 μg/ml RnaseA可以吗，还有若使细胞在上机之前分散成单细胞，用300目的筛网可以吗，谢谢

2009年8月12日 0:54

回答者：niwanmao

回复heihei2866，标准的PI染液配方请参见Current protocol in cytometry一书的相关章节http://www.flowcyto.cn/question.php?qid=114（第12页最下方），你这里提到的浓度还是有出入的，会影响染色。

另外，染好色，上机前是需要进行振荡混匀后再用300目筛网过滤的，因为染完色后很可能会产生细胞团块。

2009年8月12日 0:54