抗体的滴定方法（推荐，非常重要）

刘星宇

刘星宇 发表于 2013-1-8 22:50

                               
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第二个在炎症期应该是高表达的，另外两个不一定。但今天健康对照组的第二个结果出现整群细胞右移，高表达 ...

对于整群细胞右移，有老师认为可能是细胞胞膜受损所致，造成非特异性染色，但我们的同型对照还是好的呀。

刘星宇

倪老师好，进行抗体浓度滴定的时候，同型对照也是一样的操作吗？我们是要观察细胞胞膜受体表达的情况，应该选择饱和浓度还是最佳分离浓度？
按说明书推荐是50μl全血+10μl抗体，后来根据别人建议只加了5μl抗体，因为之前没有考虑到体积的问题，总体积就成了55μl。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-01-08 11:36:24

                               
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倪老师好，进行抗体浓度滴定的时候，同型对照也

同型对照不需要滴定。 平时使用我觉得还是应该用最佳分离浓度，一般来说，不想滴定，按照说明书做问题不是很大。至于50+5，超出了50，对于好的抗体，也不是问题

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-1-8 12:46

                               
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同型对照不需要滴定。 平时使用我觉得还是应该用最佳分离浓度，一般来说，不想滴定，按照说明书做问题不是 ...

非常感谢倪老师的解答。我们昨天加的是5μl抗体，结果整群细胞都右移，检测老师意思是说要么属于全阳性，要么是全阴性，抗体加多了，建议我们大概摸索一下浓度梯度，再减少抗体量，如：加5μl、2.5μl、1.5μl，寻找最佳分离浓度。按我们预期结果，这个胞膜受体是高表达的，但不至于全表达。那整群细胞都右移原因在哪？

附件是以前做的结果，50μl血+10μl抗体，感觉第一和第二个受体，阴阳细胞分群也是不好。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-1-8 16:28

                               
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非常感谢倪老师的解答。我们昨天加的是5μl抗体，结果整群细胞都右移，检测老师意思是说要么属于全阳性， ...

我觉得这样的图也不一定是有问题吧，有些抗原的表达可能本身就是如此吧。你的意思是这三个受体从文献上看都是高表达？

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-1-8 21:17

                               
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我觉得这样的图也不一定是有问题吧，有些抗原的表达可能本身就是如此吧。你的意思是这三个受体从文献上看 ...

第二个在炎症期应该是高表达的，另外两个不一定。但今天健康对照组的第二个结果出现整群细胞右移，高表达？拿不准，明天降低抗体量再试试。谢谢倪老师。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-01-09 08:36:06

                               
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[quote]刘星宇 发表于 2013-1-8 22:50 [url=forum.php?mod=redirect&goto=

这种右移不太像非特异性染色啊

刘星宇

从网上看到的
分群不好:
1. 细胞本身就不分群，想要"鸡蛋里挑骨头",只能挑出鸡蛋壳来!
2. 当前抗体未能有效标记!要么是抗体失效,要么是标记操作还需进一步优化!这年头,"好酒也怕巷子深"呀!
3. 流式检测的参数设计和操作有误!盲人骑瞎马,不掉到沟里才怪!
建议除设阴性对照外,再补充设计阳性对照!排除非细胞因素的影响给实验结果判断带来的"误导"!

我们的可以排除第3点，实验呀，确实不容易。周三做的减少抗体量到1μl，仍是没有分群。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-1-11 23:17

                               
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从网上看到的
分群不好:
1. 细胞本身就不分群，想要"鸡蛋里挑骨头",只能挑出鸡蛋壳来!

如果你的抗体梯度仍然做不出分群的差别。我觉得就是两种可能：一是抗体质量不行；二是本身不分群

你可以查阅一下相关文献，看别人做的分群如何。