自发荧光（auto-fluorescence）的概念？如何处理？

niwanmao

细胞中某些分子，在紫外光或某个可见光波段时可发出荧光。这种荧光是由于细胞内源性的分子造成的，所以叫做自发性荧光（auto-fluorescence）。下图列出了几种常见的细胞内导致自发荧光的物质，这些自发荧光物质通常在短波长激发和发射，例如紫外和紫光区域激发的有色氨酸类、吲哚胺类、纤维蛋白原、二聚体、胶原等，蓝光区域激发主要是NADH、脂褐质、吲哚胺类、二聚体、核黄素。


大家在实验中最常见的细胞内自发荧光通常是由还原型嘧啶核苷酸 (NAD(P)H) 和氧化型核黄素 (FMN, FAD)引起，两者都是细胞代谢的标志物。线粒体NADH自发荧光通常作为细胞呼吸的一个标志物（Piston et al.,1995）。由于只有还原型的NADH才会有明显的荧光出现，所以当缺氧时，可导致NADH/NAD+的比例增加，表现为线粒体自发荧光的增高。

自发性荧光通常具有跟FITC和PE相似的激发和发射特性，所以可干扰这两类荧光标记的检测（如下面两个图，如果用直方图分析，就会造成GFP假阳性，直接干扰GFP的检测）。这就是为什么要在FL1 VS FL2点图上进行GFP表达的分析。


再看下面两幅图，第一幅用FL1/FL2散点图分析，很明显看出黄色区域是自发荧光，绿色区域是GFP正常荧光。如果换成第二幅这样的直方图来分析，就看到这些自发荧光明显影响了GFP表达率的正确分析。





那么如何解决自发荧光问题呢？方法如下：
1、通过设门排除，主要是FL1/FL2散点图，但有时候效果可能不是很好。
2、利用化学物质移除或淬灭。如台盼蓝。但可能会导致真实信号的降低。
3、利用FL1/FL2的MFI比值来判断。自发荧光通常是1：1，FITC/GFP通常是>1:1，PE通常是<1:1。
4、终极解决办法，就是尽量避免用FITC和PB通道的荧光素，改用PE、PerCP-cy5.5、PE-cy5.5、PE-cy7等，甚至采用红光激发的荧光素APC等。

jessica77543

为什么我看不到图片？是因为网速不行吗  倪老师

niwanmao

jessica77543 发表于 2015-11-11 13:17
为什么我看不到图片？是因为网速不行吗  倪老师

这是数年前的旧帖，因为当时搬迁服务器时数据丢失了。现在已经把图片补上了。请重新审查：）

cdm874386070

niwanmao 发表于 2015-11-11 17:51
这是数年前的旧帖，因为当时搬迁服务器时数据丢失了。现在已经把图片补上了。请重新审查：） ...

PB通道是什么，没见过这个通道，可否解释下？？谢谢倪老师

niwanmao

cdm874386070 发表于 2016-11-6 11:03
PB通道是什么，没见过这个通道，可否解释下？？谢谢倪老师

Pacific Blue，是Violet激光激发的，405nm激发，450nm检测。

cdm874386070

niwanmao 发表于 2016-11-7 08:36
Pacific Blue，是Violet激光激发的，405nm激发，450nm检测。

哈哈，谢谢老师的耐心指导

wmj123456

倪老师，关于自发荧光，本底荧光，仪器的背景信号/噪音，阴性细胞群的信号，等这几个概念，有比较明确的解释吗？我们平时做实验，只检测了一管细胞，没有染抗体的，那出来的阴性信号是属于本底荧光？这里面会掺杂仪器的电子噪音吗？仪器的电子噪音，这个怎么判断？

niwanmao

wmj123456 发表于 2023-7-25 11:39
倪老师，关于自发荧光，本底荧光，仪器的背景信号/噪音，阴性细胞群的信号，等这几个概念，有比较明确的解 ...

未染色细胞，跑出来的信号，包括了电子噪音、细胞内代谢产物的自发荧光（即本底）

电子噪音，是用纯水跑的时候，看到的信号（前提是先保证液路是干净的）。

zdvfsadb

倪老师，我现在也遇到了这个问题，我不太清楚为什么GFP荧光微珠的补偿效果还不如FITC类的荧光素

niwanmao

zdvfsadb 发表于 2023-7-26 14:46
倪老师，我现在也遇到了这个问题，我不太清楚为什么GFP荧光微珠的补偿效果还不如FITC类的荧光素 ...

能具体描述一下吗？