如何合理地进行ANNEXIN V-PI凋亡检测？

niwanmao

标题：如何合理地进行ANNEXIN V-PI凋亡检测？
用流式检测凋亡时，PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致PI的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般的说明书都会标明，PI在上机前5分钟加，然后在一个小时内检测。

一般每组实验一次可以先做三个复孔，上机前5分钟加PI，最好在半小时内检测完毕。这时可以先分析下三个复孔的差异。等待摸索的实验条件成熟后，每组实验一次可以做6~8个复孔，然后做统计学分析。

严格说来，当做出统计学差异时，这样的实验还要重复三次。但是因检测凋亡时，受细胞状态，PI染色时间，流式检测时间，以及每次实验时的误差等的影响外，很难保证能够完全重复出上次的结果，甚至即使在保证了实验条件几乎相同的情况下，每次重复的差异也会出现加大的情况。这时可以适当重复2~3次，尽量使差异减小。

方法学见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1299-1-1.html

逃命的公鸡

老师，我之前买BD公司ANNEXIN V-PI双染试剂盒，说明书里面指加入了5 ul Annexin v 后再加入5 ul PI 孵育 15 min,1个小时内就上机检测。看了你的合理分析后，是否可以先加入 Annexin v 后孵育15 min， 再加入PI，继续孵育15min，再上机检测。

niwanmao

逃命的公鸡 发表于 2013-6-3 17:44

                               
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老师，我之前买BD公司ANNEXIN V-PI双染试剂盒，说明书里面指加入了5 ul Annexin v 后再加入5 ul PI 孵育 15 ...

你指的是先用annexin v孵育15分钟，然后上机前5分钟内加入PI吧？
两种方式都可以，我觉得需要根据您要检测的细胞种类，看看哪种方式更适合您的细胞。

逃命的公鸡

是的。我测试的细胞是寄生虫的细胞，16微米*2微米的大小左右，从鸡的盲肠提取后，就直接加入试剂盒的试剂就上机检测。看了你之前发的帖子《如何合理地进行ANNEXIN V-PI凋亡检测？》后，我就问问关于试剂的加入先后顺序。如果上机前5分钟加入，那么不需要避光孵育？

niwanmao

逃命的公鸡 发表于 2013-6-3 20:43

                               
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是的。我测试的细胞是寄生虫的细胞，16微米*2微米的大小左右，从鸡的盲肠提取后，就直接加入试剂盒的试剂就 ...

一般来说两种方法都可以，并非说两者一起加孵育15分钟就不行，我的意思是在前期条件摸索时你可以分别试试两种方法，如果经典的共同孵育15分钟方法PI阳性率过高，那么再改成上机前5分钟加入那种方法。上机前5分钟加入也需要避光！！！

逃命的公鸡

多谢老师指导