如何用流式分选出的微量细胞做PCR

dragonhzqsmmu · 发表于 2013-12-17 19:03:14

niwanmao 发表于 2013-12-18 11:13
单细胞PCR应该指的是以前讨论过的BEAMing技术：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2263-1-1.html

至于@ ...

BEAMing技术没太看明白是不是将经过扩增的DNA序列连接相应的荧光抗体后上流式细胞检测？

我对“如何用流式分选出的微量细胞做PCR”问题的理解是分选出来的细胞数量太少，用常规的PCR方法很难处理和扩增，因此建议使用数字PCR进行分析（之前有听过Life公司讲过的激光共聚焦切割下来的切片标本中的细胞需要进行后续的PCR扩增，感觉这个问题比较类似）

http://www.biocompare.com/Bench- ... gital-qPCR-vs-dPCR/

该链接里面指出了dPCR适用的范围：1）When you need to detect rare events；2）When absolute (versus relative) quantification is needed

刚刚又看了一些文献，发现可能普通的qPCR也能满足需要，不过可能需要特殊的裂解反转试剂，链接里面提到了1-1000个细胞也可以分析的

http://www.lifetechnologies.com/ ... -sorted-cells-.html

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（1）少见细胞的表达分析：流式分选后对稀有细胞直接行RT-PCR

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（2）单细胞PCR和定量PCR（幻灯）

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niwanmao · 发表于 2013-12-17 19:32:29

你是指细胞量太少了，提不出DNA或RNA是吧？

gcz5340 · 发表于 2013-12-17 21:43:14

有牛人经验：把EP盖剪了直接套在流式接收管上，里面加trizol，分选后细胞直接掉到裂解液里。

niwanmao · 发表于 2013-12-17 21:46:40

gcz5340 发表于 2013-12-17 21:43
有牛人经验：把EP盖剪了直接套在流式接收管上，里面加trizol，分选后细胞直接掉到裂解液里。 ...

确实牛！效果如何：）

dragonhzqsmmu · 发表于 2013-12-18 07:12:44

是不是需要用到dPCR，单细胞PCR技术？

记得ABI好像有全套解决方案的

shaniu · 发表于 2013-12-18 10:42:21

谢谢大家，可是怎么就找不到参考文献呢。抓狂啊

niwanmao · 发表于 2013-12-18 11:13:15

dragonhzqsmmu 发表于 2013-12-18 07:12
是不是需要用到dPCR，单细胞PCR技术？

记得ABI好像有全套解决方案的

单细胞PCR应该指的是以前讨论过的BEAMing技术：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2263-1-1.html

至于@shaniu 所说的，只是对分选后的细胞进行PCR，不需要这么复杂，关键是收集的细胞数量没法保证。所以我觉得你可以试试@gcz5340 版主提到的这个方法。

dragonhzqsmmu · 发表于 2013-12-19 14:26:49

gcz5340 发表于 2013-12-17 21:43
有牛人经验：把EP盖剪了直接套在流式接收管上，里面加trizol，分选后细胞直接掉到裂解液里。 ...

请教一个问题比较幼稚还请见谅，因为还没有弄过分选，分选出来的细胞会不会带比较多的鞘液到接收管里面导致trizol稀释？

niwanmao · 发表于 2013-12-19 20:04:58

dragonhzqsmmu 发表于 2013-12-19 14:44
BEAMing技术没太看明白是不是将经过扩增的DNA序列连接相应的荧光抗体后上流式细胞检测？

我对“如何用流 ...

学习了，一直以来只知道qPCR，不知道还有dPCR，我还以为你之前是笔误

非常感谢@dragonhzqsmmu 的无私分享，加分感谢！

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