单核细胞 药物干预后 FACS

xlswy1984

最近要做从buffy coat里提取单核细胞，做细胞培养，刺激干预后做流式细胞 测一些表面标记，请问大家有没有这方面的经验。
1. buffy coat 提单核细胞，是直接提取完PBMC， 接种培养去除悬浮细胞，还是用MACS的磁珠分选分离出单核细胞后，再接种。哪种比较好呀？有依据不？
2.单核细胞做这个干预刺激后流式细胞，一般是6孔板好，还是12孔板比较好。每孔接种多少细胞比较合适呀？或者说做流式细胞，细胞悬液的密度/总数多少比较合适？打算做6个表面标记的测定，4-6色的流式细胞，基本2个表面标记一个样本管。
PerCP-cy5.5 CD45
PE-cy7         HLA-DR
PB               CD14
APC             CD16
PE               CCR2
FITC            CD9
如果再加一个抗体，用什么染料标记的不会和现存的有冲突呢？
我们的机器是BD LSR II，下面是激光参数

niwanmao

1、单核细胞应该不贴壁的，我觉得通过去除悬浮细胞纯化不靠谱。还是用磁珠分选纯化更好。
2、你这六种颜色不是可以放在一管吗？为什么要分开呢？此外，你如果要增加一种标记，不知道你的仪器配置如何？

xlswy1984

niwanmao 发表于 2014-1-9 09:23
1、单核细胞应该不贴壁的，我觉得通过去除悬浮细胞纯化不靠谱。还是用磁珠分选纯化更好。
2、你这六种颜色 ...

倪老师，您好！
1. 单核细胞是贴壁的，我在想buffy coat里有500mioPBMC， 如果有MACS分选，一个盒子只能做两次。有文献也是培养2-4个小时，去除悬浮细胞的。我不知道用MACS值不值得。
2. 这个6个颜色，我是放在一个管子里的。现在考虑买抗体，希望能用另一钟颜色标记，这样，如果我想做这7个颜色一起，就不用另外买抗体。所以想问，如果再加一种，什么比较合适。我们的仪器是 BD LSRII，应该是4色激光管的。

xlswy1984

FACS 激光参数

niwanmao

xlswy1984 发表于 2014-1-9 15:19
倪老师，您好！
1. 单核细胞是贴壁的，我在想buffy coat里有500mioPBMC， 如果有MACS分选，一个盒子只能 ...

外周血中的单核细胞应该是悬浮的吧，当它到组织中成为巨噬细胞时，才会贴壁吧？我是这么觉得的。：）

至于荧光标记的选择，你可以参考一下下面这张图片：

xlswy1984

niwanmao 发表于 2014-1-9 19:28
外周血中的单核细胞应该是悬浮的吧，当它到组织中成为巨噬细胞时，才会贴壁吧？我是这么觉得的。：）

至 ...

那请问，这个选择染料的原则呢，我时常很糊涂，在选择空间比较大的时候，我就会选择 不同荧光通道探测器的。
为了避免染料的发射光谱 在不同探测器之间的交叉干扰，就需要 补偿，就需要尽量选择发射光谱 差距较大的燃料。

请问：
1. 在选择染料时，到底是看 不同Laser，还是看最后的荧光通道探测器。如倪老师上图示：Laser Blue 激发的光有Green/Yellow/Red/Infra red四个通道探测， Laser Red 激发的光有Red/Infra red两个通道探测，PerCP和APC 应该是不可以同时选的吧。
2. 比方说我们的机器：有四色激光，6个探测器ABCDEF。
       荧光通道探测器B可探测不同的颜色光（orange，green，far red）如（PI、FITC、Alexa Four700）。探测器E可探测（green， yellow）（Amyan、PE）。这个时候我就糊涂了，因为不同的探测器可以探测不止一种的光谱，这个时候是要看 尽量避免 探测相同颜色的光么？和荧光通道探测器有关么？
可不可以归结为：燃料的选择，只是要看最后激发光谱的颜色，只要颜色不一样，就可以，和哪个荧光通道探测器无关。

niwanmao

xlswy1984 发表于 2014-1-9 22:15
那请问，这个选择染料的原则呢，我时常很糊涂，在选择空间比较大的时候，我就会选择 不同荧光通道探测器 ...

PerCP和APC可以同时选，因为在不同通路上。

荧光能不能同时测，除了跟激发光波长、发射光波长有关，还跟光路设计有关，既然搞不清楚，那么就按照上面这张图选呗

xlswy1984

niwanmao 发表于 2014-1-9 22:23
PerCP和APC可以同时选，因为在不同通路上。

荧光能不能同时测，除了跟激发光波长、发射光波长有关，还跟 ...

请问这个和机器有关么？您上面那张图，适合LSR II么？
我们的laser 是violet， sapphire， red， Y/G

niwanmao

xlswy1984 发表于 2014-1-9 22:34
请问这个和机器有关么？您上面那张图，适合LSR II么？
我们的laser 是violet， sapphire， red， Y/G ...

机器配置不同，可能会略有差异。我传的这张图是经典配置所适用的，如果你的LSR Ⅱ配置上变动过，就按照你们机器的配置来做。无需过于担心。

xlswy1984

niwanmao 发表于 2014-1-9 22:38
机器配置不同，可能会略有差异。我传的这张图是经典配置所适用的，如果你的LSR Ⅱ配置上变动过，就按照你 ...

请问：单核细胞做这个干预刺激后流式细胞，一般是6孔板好，还是12孔板比较好。每孔接种多少细胞比较合适呀？或者说做流式细胞，细胞悬液的密度/总数多少比较合适