流式细胞术如何正确进行设门？

niwanmao

在正确、完美的染色和获取标本之后，就是最困难的工作－数据分析了。数据分析时，需要根据自己的实验设计和生物学知识，圈出正确的感兴趣的细胞，也就是“设门”。设门就是数据精简过程，通过设门，我们将后续的分析焦点集中在门内的细胞，而门外的细胞，即使只相隔一点点距离，也不会去分析它。

那么如何做到流式正确地设门呢？
1、首先需了解感兴趣的细胞群特征。可能这句话听起来似乎与分析过程相反，因为我们分析目的就是为了了解细胞特征，如果了解细胞特征不是意味着我们不需要分析了。不是这个意思，设门前我们可通过已发表的文献、以前的实验数据等大概了解目的细胞群的特征，利用这些特征，方可检查我们的染色是否正确、对照是否正确设置。

2、细胞大小不是全部。单纯利用FSC、SSC来设淋巴细胞门非常危险，因为幼稚淋巴细胞会比静止的淋巴细胞要大，通过FSC、SSC圈，容易使其漏掉。可以使用FSC、SSC散点图来排除细胞碎片（FSC、SSC散点图的左下角）。

3、检查标本获取的稳定性。绘制一个Time vs FSC或SSC的散点图，可检查液流的稳定性如何。这可以让我们消除由于液流不稳定造成的假信号。下图中，左侧是液流稳定，右侧是液流不稳定。




4、去除粘连体。如下图所示，当细胞通过激光束时，粘连细胞通过的时间会比单个细胞要长，因此信号的面积会比较大，所以通过FSC-H vs FSC-A散点图，可排除粘连体。


5、让对照成为你设门的指导。实验中的对照对于正确分析十分重要。例如，FMO对照（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2221-1-1.html）对于多色实验中门的正确放置就非常关键（如下图），在多色实验中，其它荧光的渗漏是无法通过单纯一个同型对照可以纠正的，此时，只有FMO对照才可以反映正确的荧光渗漏。


从上图可以看出，如果没有FMO对照，这些红色虚线中的细胞很可能会被我们误圈进去。

6.  利用好反设门。反设门可使我们回过头去查看我们之前的设门是否正确，圈的细胞是否真正的目的细胞（见下图）。

hbezyr

学习了！

钢蛋儿

通俗易懂，挺有用的，感谢！！4 去除粘连体。如下图所示，当细胞通过激光束时，粘连细胞通过的时间会比单个细胞要长，因此信号的面积会比较大，所以通过FSC-H vs FSC-A散点图，可排除粘连体。

chunhuii

很好！ 去除粘连体一直没有做正确，今天才发现！

shoenchen

形象，易学，易懂，感谢楼主

RIVA

对于有些处理后的细胞或者个别病人溶血后的样本来说，有一些细胞的类似碎片的东西，会呈现在我们要分析的细胞中，这种情况该怎么办了？
是不是需要加一些判断细胞死活的标志呢？

niwanmao

RIVA 发表于 2014-4-25 14:19
对于有些处理后的细胞或者个别病人溶血后的样本来说，有一些细胞的类似碎片的东西，会呈现在我们要分析的细 ...

那种应该不是细胞碎片，而是死细胞，加鉴别标记当然最好，不过大部分还是可以通过设门排除的。

RIVA

niwanmao 发表于 2014-4-25 19:36
那种应该不是细胞碎片，而是死细胞，加鉴别标记当然最好，不过大部分还是可以通过设门排除的。 ...

恩~那对于低频细胞，如CD34的检测，不知道倪老师是采用什么方法呢？用的是什么试剂呢，有推荐的么？

niwanmao

RIVA 发表于 2014-4-28 15:20
恩~那对于低频细胞，如CD34的检测，不知道倪老师是采用什么方法呢？用的是什么试剂呢，有推荐的么？ ...

CD34干细胞有标准的ISHAGE方案，参见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2765-1-1.html

wfz

又学到了一点知识