关于细胞周期染色和Modfit分析的问题

laoyeche · 发表于 2014-2-20 16:05:50

做细胞周期染色，用70%酒精4°固定过夜，PI染色30分钟。在网上查到有同时用100ug/mLRNase A和0.2%Triton X-100处理一下，请问：
1、不加RNase 和Triton X-100 这个问题大么？

2、样本有什么要求？需要是同一种细胞吗？我用的是PBMC，阴性组不刺激，阳性组用anti-CD3+anti-CD28刺激2-3天。不处理组是不是也应该出现两个峰型的？

3、用Modfit LT 4.0分析实验结果，Gate1是FSC和SSC，Gate2是FL2-W和FL2-A，最后是FL2-A的histogram，但是出来的图是扁平的，没有两个尖峰型。是分析有问题还是样本处理的这个过程的有问题呢？

niwanmao · 发表于 2014-2-20 19:11:48

1、要加，详细protocol见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1330-1-1.html。RNAse的作用是防止RNA干扰，影响倍体检测，Triton X-100的作用是打孔，使PI进入细胞核内。

2、样本无特殊要求，如果是多种细胞混杂，建议加一个表面标记，以准确区分倍体来源。不过此时可能最好改用7-AAD，以取得更好的染色效果：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3034-1-1.html

3、设门没问题，就是不知道你圈的细胞如何，建议把图或者原始数据传上来看看。

laoyeche · 发表于 2014-2-20 20:59:05

niwanmao 发表于 2014-2-20 19:11
1、要加，详细protocol见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1330-1-1.html。RNAse的作用是防止RNA干扰， ...

倪老师您好，把数据传上来了，麻烦您帮我看一下

niwanmao · 发表于 2014-2-20 21:11:35

laoyeche 发表于 2014-2-20 20:59
倪老师您好，把数据传上来了，麻烦您帮我看一下

这两个文件确实看不出明显的峰，不知道你的细胞是否用Triton X-100打孔过？

laoyeche · 发表于 2014-2-20 21:17:03

niwanmao 发表于 2014-2-20 21:11
这两个文件确实看不出明显的峰，不知道你的细胞是否用Triton X-100打孔过？ ...

没有打孔，因为有看到网上有人说Triton X-100和RNase影响不大，就没有加。是这个原因导致的吗

niwanmao · 发表于 2014-2-20 21:43:00

laoyeche 发表于 2014-2-20 21:17
没有打孔，因为有看到网上有人说Triton X-100和RNase影响不大，就没有加。是这个原因导致的吗 ...

难怪没做出来，影响当然大了。要寻找权威的protocol，就象寻找正规的治病方法一样，别随便百度一个就行，要到“流式中文网”

laoyeche · 发表于 2014-2-20 21:56:17

好的，我明天再试试，谢谢倪老师

laoyeche · 发表于 2014-2-21 21:08:35

niwanmao 发表于 2014-2-20 21:43
难怪没做出来，影响当然大了。要寻找权威的protocol，就象寻找正规的治病方法一样，别随便百度一个就行， ...

您好，今天做的峰确实好很多，但是modfit的auto不好用啊，自动分析之前还要有什么设定么？我打开数据以后直接点击auto没有反应，而且横坐标也没有见到可以指示峰的三角。

niwanmao · 发表于 2014-2-21 22:01:51

laoyeche 发表于 2014-2-21 21:08
您好，今天做的峰确实好很多，但是modfit的auto不好用啊，自动分析之前还要有什么设定么？我打开数据以后 ...

一般除非非常典型的峰，AUTO才会准确，多数情况下科研标本都需要用MANUAL模式，需要调整MODEL里面的参数。这样吧，我下周二安排一个在线讲座，分享一下我自己用MODFIT分析细胞周期的方法。

laoyeche · 发表于 2014-2-22 09:07:02

niwanmao 发表于 2014-2-21 22:01
一般除非非常典型的峰，AUTO才会准确，多数情况下科研标本都需要用MANUAL模式，需要调整MODEL里面的参数 ...

太好了！谢谢您

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