ARIA分选纯度问题

lin850424

CD4-FITC;CD25 APC,ARIA2流式分选CD4+CD25+双阳性的细胞，问题在于分选出来的纯度很低才70%左右，（新鲜血液ficoll分离淋巴细胞，然后标记抗体，直接分选），到底是什么原因呢？
CD25 APC 分群不明显如图，本来想上传个样本图的，结果覆盖了，所以就上了一个单标图。
还有个图是回测纯度的，结果就出现了有一部分CD4+CD25-的细胞，我想要的CD4+CD25+才70%。
难道分选分群不明显的细胞就这样？

gcz5340

这种属于非独立群体的分选，阴性和阳性很难分开，P4门的下线其实是阴性细胞和阳性细胞的混合区域，所以很正常有一部分阴性细胞过来。这种分选，如果你想纯度高，只能尽量把P4门向上拉，牺牲得率保证纯度。@dragonhzqsmmu 也是一种方法，不过二次分选细胞损失的也很厉害。

如果方便，楼主可以考虑换个CD25抗体试试，有时候CD25能够分群的，不过也不能保证。
或者试下美天旎公司的一个荧光增强试剂FASER kit-APC，增强荧光让阴性和阳性离的开一点，我最近正想试试效果，有结果来跟大家分享。

niwanmao

确实，对于这类分群不明显的细胞，分选时由于仪器是有点类似于模糊分选的理念，所以会出现一些阴性区域的细胞。有请@gcz5340  版主更详细的回答。

dragonhzqsmmu

这种情况是否可以把分选好的细胞再上一次分选？

dragonhzqsmmu

荧光增强试剂FASER kit-APC这个试剂的原理是什么？能帮忙把negative/dim/bright的三群界限显示清楚，还是有助于连续表达抗原的分群？

dragonhzqsmmu

从说明书的图示来看，感觉这个试剂有点像ELISA的级联放大反应的效果
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NTQyNXxlMDlhZWE1YnwxNzM0ODY3ODE3fDB8

lin850424

gcz5340 发表于 2014-3-20 18:43
这种属于非独立群体的分选，阴性和阳性很难分开，P4门的下线其实是阴性细胞和阳性细胞的混合区域，所以很正 ...

CD25抗体换过一次了，之前用过percp-cy5.5的，分群也不开，不过感觉要比APC好一些，纯度高一些，但是也仅在80%左右吧，总不能挨个试吧，期待gcz5340您的荧光增强试剂的效果！

lin850424

gcz5340 发表于 2014-3-20 18:43
这种属于非独立群体的分选，阴性和阳性很难分开，P4门的下线其实是阴性细胞和阳性细胞的混合区域，所以很正 ...

CD25抗体换过一次了，之前用过percp-cy5.5的，分群也不开，不过感觉要比APC好一些，纯度高一些，但是也仅在80%左右吧，总不能挨个试吧，期待gcz5340您的荧光增强试剂的效果！