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本帖最后由 infouniv 于 2014-4-18 16:40 编辑
免疫荧光染色是进行免疫标志分析的关键步骤，主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。 上海优宁维生物科技有限公司
间接免疫荧光染色是采用特异的无荧光标记的一抗与待测标本反应，经溶血、洗涤后，加入标记荧光的一抗抗体，经过孵育、洗涤后上机检测。在应用FCM的初期，由于标记荧光抗体的单抗较少，多采用间接免疫荧光标记方法。而随着抗体的发展，目前标记荧光的抗体越来越多，因此不必再采用此方法了。而间接标记的方法难以进行多色的标记，这是该方法的另一个主要缺点。再加上操作复杂、费时、信噪比高，因此目前基本不再应用了。但是，在科研中需要研究一些新的抗原，而这些抗原可能无直接标记荧光的抗体，此时只能采用此方法。 直接免疫荧光染色是在标记时加入连接着荧光素的特异抗体，该方法具有操作简单、背景荧光低、信噪比低、可同时标记多色抗体等诸多优点，目前广泛应用各实验室。 按照同时加入连接着标记荧光素抗体的数目不同，直接免疫荧光染色法可分为单色和多色免疫荧光染色法。 1 单色免疫荧光染色法 在每一管待测的标本中加入一种荧光素标记的单克隆抗体与待测标本反应，经溶血、洗涤、固定后进入流式细胞仪检测，省去了加二抗的步骤。因单色标记法每管只能检测一个抗原，难以在混合的细胞群体中检测特异细胞的抗原表达，往往不能满足目前的临床检测需要，应用较少。
2 多色免疫荧光染色法 用2种、3种、4种或者4种以上单克隆抗体分别标记不同荧光素（经不同的荧光检测通道），同时与待测细胞反应，经溶血、洗涤、固定后进行流式细胞仪检测，每管可同时检测多种抗原的表达。目前应用较广的是三色（FITC、PE和Percp）和四色（FITC、PE、Percp和APC）免疫荧光标记法。随着多激光管流式细胞仪的出现、标记单克隆的荧光素种类的增加，4色（6色、9色、17色等）以上免疫荧光标记逐渐应用于科研和临床检测，为精确地界定不同类型的细胞提供了可靠的保障，而且可以同时观察多种抗原间的表达关系，大大减少了重复抗体的使用，有效节约了抗体和标本用量。更重要的是可以提供更多的信息。但4色以上免疫荧光标记对仪器的要求更严格，同时补偿的调节更为复杂，目前应用还未普及。 根据标记抗原部分的不同，可分为细胞表面和细胞内抗原染色，标记的方法有差别，后者需要固定、破膜等步骤，下面以4色免疫荧光标记为例，着重介绍细胞表面抗原和细胞内抗原染色的步骤。
（1）细胞表面抗原标记 细胞表面分子主要是从细胞内合成后表达在细胞膜表面，各种细胞表面抗原或受体的 流式细胞表型在临床中应用最广泛，标记和检测也相对简单。 1） 分别加入四种荧光素FITC、PE、PerCP和APC标记的单克隆抗体，不同试剂生产生 产的抗体依据说明书和细胞总数来确定抗体用量。以BD公司的抗体为例，以1X10e6细胞，FTIC、PE和PerCP标记的抗体用量一般分别为20ul，APC标记的抗体用量为5ul。 2） 标记：按照上述标本准备方法，加入适量50-100ul的抗凝骨髓（或其他类型）标 本，充分混匀后室温避光孵育15min。 3） 溶血：加入1XFACS溶血素2ml，低速涡流混匀，室温避光静置8-10min；如标本 量较大，红细胞较多，需多加入1ml溶血素。溶血后以300g离心5min。 4） 洗涤：弃去上清，加入1ml含有0.1%NaN3和1%-2% BSA的PBS洗液，以300g离 心洗涤5min。 5） 上机检测：弃去上清后加入PBS 200-500ul（依细胞浓度而定），上机检测。如不能 及时上机检测，则加入同样体积的1%多聚甲醛，混匀后置于4°冰箱内保存，一般不超过24h。 另外，部分特殊要求的标本需要不同的方法。例如为了避免FC受体的非特异性结合，在标记Kappa和lambda抗体石，要先用无血清PBS洗涤待测标本3次，离心后再标记、溶血、洗涤和上机检测。
（2）细胞内或核内抗原标记 除表达在细胞表面的分子外，细胞内还存在大量分子或待分泌的细胞因子等，它们发挥着重要的生理作用。了解细胞内或核内抗原、细胞因子的表达情况，对临床疾病的诊断、预后判断及发病机制的研究等均有重大意义。但是，与细胞膜表面抗原标记相比，细胞内或核内抗原的标记首先需要透膜处理，而透膜是否合适直接影响胞内抗原的标记，因此在检测时要特别小心。随着流式分析技术的不断发展，目前细胞内或核内抗原的应用正逐渐增多。下面将简述在血液学主要涉及的三种最常用且具有代表性的抗原标记方法：细胞内和核内抗原分析、细胞内细胞因子的测定。 在血液系统疾病的诊断中，常需要鉴别诊断细胞的系列特性。而一些系列特异性标志首先出现于细胞内或核内。例如髓系标志物髓过氧化物酶（MPO）、B淋巴细胞抗原标志物、T淋巴细胞抗原标记物、未成熟细胞抗原标志物、B淋巴细胞和浆细胞的抗原标志物等，对于诊断不同类型的白血病和淋巴瘤具有重要的临床价值。 检测细胞内或核内抗原时通常需要同时标记细胞膜表面抗原，与单纯标记膜表面抗原的主要区别是首先标记膜抗原，然后在标记细胞内或核内抗原前对细胞膜和核膜进行透膜和固定，即在细胞膜和核膜上打孔，以便让荧光素标记的抗体自有通过细胞膜和核膜，同时又不能破坏细胞的结构，并尽量保持靶抗原的抗原性和细胞的散射光特点。对胞内抗原的检测，透膜是关键的步骤。如果透膜不完全，可能造成假阴性。而透膜不好，则改变CD45和SSC特性。文献报道某些胞内抗原需要不同的透膜剂。因此在进行胞内抗原的检测前应该进行预实验，以选择合适的透膜剂。另外在观察结果时可以在标本中残留的正常细胞作为内对照。例如检测MPO时，正常粒细胞应该为阳性。检测Ccd3时，正常T细胞应为阳性。而这些正常细胞如果为阴性，说明本次检测检测的结果不可靠。应分析失败的原因是什么，是试剂问题还是标记问题；发现原因纠正后重新进行标记，直到阳性对照没有问题为止。我们目前标记MPO和CD79a时，采用同一公司生产的抗体和透膜剂，阳性对照均很好。而检测Ccd3HE tdt时，因抗体是不同公司的，故采用CALTAG透膜剂，结果也不错。
胞膜和胞内抗原同时标记的具体步骤如下: 1 膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量抗凝骨髓（或其他类型）标本，充分混匀后室温避光孵育15min 2 溶血：加入1XFACS溶血素2ml，低速涡流混匀，室温避光静置8-10min 3 洗涤：弃去上清，加入1ml PBS洗液，300g离心洗涤5min 4 透膜与固定：用透膜剂处理，固定细胞膜并使其通透。在此介绍两种透膜剂的使用方法：BD FACS和CALTAG 透膜剂。 BD FACS透膜剂的使用：加入500ul透膜剂，低速涡流混匀，温室作用10min，加1ml PBS，300g离心300min。 CALTAG透膜剂的使用：加入100ul透膜剂A液，低速涡流混匀，室温作用15min，加PBS 1ml，300g离心5min，弃去上清，加入100ul透膜剂 B液，同时加入相应的荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育15min。 5 细胞内抗原染色：加入相应的荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育30min（CALTAG透膜剂省去此步骤） 6 洗涤：弃去上清，加入1ml含有1%NaN3和1%-2% BSA的PBS洗液，300g离心洗涤5min。 7 上机检测：弃去上清后加入PBS 200ul，上机检测。如不能及时上机检测，则加入0.5ml 1%多聚甲醛，混匀后置于4°冰箱内保存后检测。 值得注意的是，在标记ckappa和clambda时，在标记细胞前先用无血清PBS洗涤3遍，然后进行跑膜抗原标记、溶血、洗涤、胞内抗原标记和洗涤、上机检测。
（3）细胞内细胞因子的测定 细胞因子在细胞系统调节中起着非常重要的作用，常用检测方法是以分泌后释放至外 部环境的细胞因子检测为基础，一般来说选用酶联免疫吸附实验ELISA或放射免疫分析法RIA，虽然敏感且可以定量，但测定的是每单位体积中细胞总体分泌的平均细胞因子水平。为了界定产生某种细胞因子的细胞类别、表型、层顶实际产生细胞因子的细胞数量或比例，有必要寻找新的方法检测单细胞内的细胞因子。目前常用的方法有酶联斑点免疫技术ELISPOT和流式细胞术，后者是一种有效的分析单个细胞的技术，可同时分析多个参数，可从单细胞水平检测不同亚群产生的细胞因子，不但能了解细胞因子的量和产生细胞因子的细胞类型，而且可以检测同一细胞内分泌的不同细胞因子。 胞内细胞因子检测的基本原理：通过应用细胞内蛋白分泌抑制剂，如莫能菌素和布雷非尔德菌素，阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运，使细胞因子聚集、蓄积，不能分泌到细胞外，增强了细胞因子信号。结合膜表面抗原染色，进行流式细胞分析。方法如下： 1） 单细胞悬液的制备 2） 细胞的活化：除检测高封堵的和病理情况下表达异常亢进的细胞因子，可直接标记 细胞外，一般先活化细胞，使之合成欲检测的细胞因子。活化T细胞除用抗原外，还有植物凝集素PHA，佛波酯PMA，钙离子载体，T细胞受体抗体和CD3抗体等；活化B细胞除抗原外，还可以用脂多糖LPS，金黄色葡萄球菌肠内毒素A及B细胞受体抗体。活化单核细胞可用LPS和某些细胞因子等。一般可将激活剂配成一定浓度加入血液或单核核细胞悬液中，同时加入一定浓度的莫能菌素或BFA，培养一定时间如4-6H后即可刺激淋巴或单核细胞产生细胞因子。 3） 细胞表面抗原和细胞内细胞因子的染色： ——收集细胞，收集上述活化的细胞 ——封闭FC受体：加入过量的来源于抗体生产动物同种属动物的无关的纯化免疫球蛋白IG（1-10ug/10e6细胞）或FC受体的抗体，可以阻断与单克隆抗体的非特异性结合。 ——细胞表面抗原染色：选择适当的荧光素标记抗体和适量活化细胞，按照膜表面抗原染色法进行染色。 ——固定和透膜：全血标本加入2ml BD 1XFACS溶血素溶解红细胞，室温放置8-10min，300g离心5min，弃去上清；加入2mlPBS，低速涡流混匀，500g离心5min，弃去上清。加入500ul 1X BD透膜剂，低速涡流混匀，室温10min，300g离心5min，弃去上清。 ——细胞内细胞因子染色：加入适当浓度的荧光素标记的细胞因子抗体，4°避光孵育30min。 ——洗涤：弃去上清，加入1ml含有0.1%NaN3和1%-2% BSA的PBS洗液，300g离心洗涤5min。 ——上机检测：弃去上清后加入PBS 200ul，上机检测。 4） 染色对照：细胞内细胞因子涉及体外细胞激活或培养过程，设置阳性对照和阴性对照对于结果的分析非常重要。 ——阳性对照：可利用一系列产生特定细胞因子的细胞系或预先经活化并被固定的阳性对照为对照细胞。 ——阴性对照：反应单克隆抗体的非特异性结合水平，包括免疫球蛋白同型对照、配体封闭对照和未标记抗体封闭对照。 ——免疫球蛋白同型对照：指用非相关特异性的同型匹配抗体作为对照。 ——配体封闭对照：指的是预先用同类的细胞因子与荧光素标记的抗细胞因子抗体孵育，预封闭其抗体结合位点，然后再与经固定和透膜处理过的细胞作用。 ——未标记抗体封闭对照：用未标记荧光素的细胞因子抗体与固定和透膜处理的细胞孵育后，再用标记荧光素的细胞因抗体与细胞共培养。 | 
发表于 2014-4-14 13:41:03
发表于 2014-4-16 21:41:02