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艾森ACEANovoCyteTM流式细胞仪细胞绝对计数在临床中的应用 —无需微球绝对计数新体验
摘要：由于特定细胞群体的绝对计数在临床诊断、治疗及预后等方面均具有重要意义，因此绝对计数在流式临床诊断中有着广泛的应用，如白细胞计数、血小板计数、CD4+T细胞计数检测艾滋病及CD34+造血干细胞计数等。本文详细介绍了使用具有ACEA自主知识产权的流式细胞仪ACEA NovoCyteTM在艾滋病检测与造血干细胞移植中的具体应用。 HIV侵入人体后主要攻击的是一种带CD4抗原的淋巴细胞（辅助性T淋巴细胞）。这种细胞是免疫系统的基本组成部分，HIV通过大量、不断地复制与释放，导致CD4+T淋巴细胞进行性下降，感染者免疫功能遭到严重破坏，造成免疫缺陷。临床表现为各种各样机会性感染与肿瘤。 人体感染HIV后，CD4细胞的数量与功能的降低是引起人体免疫功能缺陷的主要原因。CD4细胞的数量是确定诊断、疾病分期、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案的标准实验指标。目前CD4细胞的测定已广泛应用于HIV感染者的临床管理，协助判断感染者的预后、指导实施抗病毒治疗和疗效观察以及药物预防机会性感染等多个方面，同时它也是WHO对艾滋病发病定义的金标准。 CD4 +T 淋巴细胞计数的参考范围是 550~1440 个 /μl。当 HIV 感染后，其数量减低，表明病毒已经直接或间接地引起了这些细胞死亡或重新分布。一般认为，当血液中 CD4 +T 淋巴细胞< 400 个/ μl时，提示 HIV 病毒己损伤了免疫系统；当< 200 个 / μl时，则有诊断意义。由于血液中CD4 +T 淋巴细胞数量与免疫抑制有高度的相关性，美国疾病控制中心(CDC )于 1992 年将 CD4 +T 淋巴细胞<200 个 /μl 时没有任何临床症状的HIV 感染者也为定义AIDS 。
二、干细胞绝对计数在造血干细胞移植中的意义 干细胞移植对于白血病等多种疾病的治疗具有重要意义，而准确的干细胞绝对计数对于干细胞移植的成败又十分重要。 造血干细胞移植（HSCT）是治愈某些恶性血液病的方法，也是治疗某些免疫性疾病、遗传性疾病、代谢性疾病、尤其是某些实体肿瘤的根本途径。对于有计量要求的造血干细胞移植方案而言，精确的造血干细胞计数是十分重要的。20世纪80年代，CD34分子被发现，CD34+造血干细胞在正常骨髓单核细胞中的相对含量约为1%-4%，在外周血中一般小于0.1%。为评估骨髓动员效果，判断最佳采集时机，用流式细胞术进行CD34+造血干细胞计数已成为造血干细胞移植的最常规检查之一。
三、ACEA NovoCyteTM流式细胞仪无需耗材完成绝对计数的原理 NovoCyteTM采用高精度注射器吸取样本，然后将样本推入流动室，进行检测。该进样方式可以精确控制样本体积量，通过采集到的细胞数目、样本体积、总体积、绝对数目单位计算得到单位体积内特定细胞的总数。 Abs. Count = Count / Ve / Df / Abs.Unit
其中Count是群的事件数目，Ve是实验样本体积，Df是稀释比例，Abs. Unit是绝对数目单位。稀释比例、绝对数目单位可在“样本”菜单的“绝对计数设置”中进行设置，自动生成结果。
绝对计数原理和计算公式
四、CD4+细胞绝对计数在艾滋病检测中的应用： 实验采用血液样本，实验过程中取出流式管做好标记，然后向管中加入20μlCD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP抗体到管内。再准确加入50μl充分混匀的抗凝全血。 盖上盖子，涡旋混匀，室温避光孵育15min。再加入250μlLysing Solution，涡旋混匀，室温(20~25℃)避光孵育10min。加入250μlPBS，涡旋混匀，室温(20~25℃)避光孵育10min。上机按以下步骤测试。
1.选中“
Novocyte程序图标
”软件图标，双击进入NovoCyte软件用户操作界面，点击“
保存按钮
”设置文件保存目录D：//Data，在默认文件名后添加“HIVTest”，输入测试停止条件为30μl，选择样本流量为Slow（FlowRat:14μl/min ; Core Size：7.7μm），设置Threshold：FSC-H=250,000，PerCP-H=100，选择本次实验需要使用的荧光通道:FITC（CD4）、PE(CD8)和PerCP(CD3)，并命名为CD4-FITC、CD8-PE和CD3-PerCP，点击按钮Run，启动测试。
2. 选择工具栏中的“
散点图绘制图标
”按钮，绘制FSC-SSC、CD3-SSC、CD4-SSC、CD8-SSC、CD3-CD4、CD3-CD8散点图，通过按钮“
放大
”或“
缩小
”调节坐标轴，使各细胞群显示充分。
3. 选择工具栏中的“
补偿调节按钮
”按钮，拖动出现在各散点图正上方及右方的拉条快速调节荧光补偿。
4.点击图下方的“
绝对计数设置按钮
”按钮，打开数据统计表，在表的标题栏上右键勾选并添加“Abs.Count”，在“ ”设置本次实验样本体积50μl及样本总体积570μl。
绝对计数设置
5.点击
统计表按钮
按钮，打开数据统计表，选择并添加需要统计的数据，将统计表格命名为“CD4+T”。表中显示为CD4+TAbs. Count一栏，即为CD4+细胞的密度为32.3个/μl。
6. 结果
CD4＋绝对计数分析结果
五、CD34+细胞绝对计数在造血干细胞移植中的应用： 实验采用骨髓样本，实验过程中取出流式管做好标记，然后向管中加入20μlCD45 PE-cy7/CD34 PE抗体到管内。再准确加入50μl充分混匀的骨髓。 盖上盖子，涡旋混匀，室温避光孵育15min。再加入250μlLysing Solution，涡旋混匀，室温(20~25℃)避光孵育10min。加入250μlPBS，涡旋混匀，室温(20~25℃)避光孵育10min。上机按以下步骤测试。 1.选中“ ”软件图标，双击进入NovoCyte软件用户操作界面，点击“ ”设置文件保存目录D：//Data，在默认文件名后添加“CD34，输入测试停止条件为30μl，选择样本流量为Slow（FlowRat:14μl/min ; Core Size：7.7μm），设置Threshold：FSC-H=250,000，PerCP-H=100，选择本次实验需要使用的荧光通道: PE（CD34）和PE-Cy7(CD45)，并命名为CD34-PE和CD45-PE–Cy7，点击按钮Run，启动测试。
2. 选择工具栏中的“ ”按钮，绘制FSC-SSC、CD45-SSC、CD34-SSC散点图，通过按钮“ ”或“ ”调节坐标轴，使各细胞群显示充分。
3. 点击图下方的“ ”按钮，打开数据统计表，在表的标题栏上右键勾选并添加“Abs.Count”，在“ ”设置本次实验样本体积50μl及样本总体积570μl。
4.点击 按钮，打开数据统计表，选择并添加需要统计的数据，将统计表格命名为“CD34+”。表中显示为CD34+Abs. Count一栏，即为CD34+细胞的密度为493个/μl。
5. 结果
CD34干细胞分析结果
参考文献： 北京市临床流式细胞分析协作组.流式细胞仪单平台技术调查成年人外周血T 淋巴细胞亚群绝对计数参考范围.中华检验医学杂志， 2003， 26:123~125 Sprent, J. “T lymphocytes and thymus”, 1989,Fundamental immunology, 2nd edition, paμl W.E. Raven Press, P.69-93. 北京市临床流式细胞分析协作组.流式细胞术三色分析调查成年人外周血 CD34 +造血干细胞绝对计数参考范围.中华检验医学杂志， 2002， 25:58~60
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发表于 2014-4-17 19:51:57
发表于 2014-4-23 19:07:42
