新手，急求帮忙分析细胞周期！！

kansic

请前辈分析下这个数据，小弟身边没有人做这个，自己比较笨，看了半天资料，也不懂得分析，导师又催了好几次，只能先拜托前辈

didi_zhou

kansic 发表于 2014-7-25 13:23
你好，这是我做的操作步骤，因为我的细胞带mcherry的荧光，所以实验室师兄建议我用DAPI染色
1、将生长状态 ...

1. 不用多聚甲醛。
2. 直接用乙醇固定，纯水配，不要用PBS先重悬，析出的盐结晶会破坏细胞。
3. 固定后不用PBS洗，离心后直接染色。
4. 染色时间可以适当加长。
5. 操作要轻柔，减小吹打力度，最好用涡旋不要用枪头。

酒精固定以后细胞很脆弱，减少操作次数。

kansic

这个是贝克曼的机器做的，文件格式是LMD

didi_zhou

Gallios做的，样本制备有问题，没有分析的必要，重新优化一下样本制备以及你的染色方法，你这个是单色分析，可以试试PI。

kansic

didi_zhou 发表于 2014-7-25 12:53
Gallios做的，样本制备有问题，没有分析的必要，重新优化一下样本制备以及你的染色方法，你这个是单色分析 ...

你好，这是我做的操作步骤，因为我的细胞带mcherry的荧光，所以实验室师兄建议我用DAPI染色
1、将生长状态良好的细胞用PBS洗2次，用胰酶消化，细胞数量约10^6/ml。
2、将单细胞悬液加入2ml EP管中，离心，1000g, 5min，弃上清液。
3、加入含4%多聚甲醛的PBS 1ml，冰上孵育15min，离心，弃上清。
4、加入PBS 1ml离心洗涤3次，离心，弃上清。
5、加入500ul PBS重悬细胞，将重悬的细胞缓慢加入预冷的无水酒精（-20°C,1167ul），终浓度70%， 4℃固定过夜。
6、离心，1000g，5min，弃上清。
7、用PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入配好的DAPI 1ml，室温避光孵育超过5min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中，待测。

niwanmao

奇怪，DAPI在beckman机器上是FL9吗？  @didi_zhou

didi_zhou

niwanmao 发表于 2014-7-25 20:37
奇怪，DAPI在beckman机器上是FL9吗？  @didi_zhou

Gallios上面是9。B+R+V=5+3+2，10色。

kansic

两位老师给我的帮助都很大，只是最佳答案只能一个，就给流星少的didi_zhou{:soso_e100:}