抗体孵育时间

fdgg012345

倪老师@niwanmao ，我一个抗体（胞膜）用的是间标，一抗是之前买过来做免疫组化的，试着做了一下流式，但是阳性比例感觉比预期低很多。做免疫组化时，孵育时间是4摄氏度过夜或者37摄氏度1h，而我做流式时只是室温孵育了30min，是不是太短了？请问也应该和免疫组化一样的孵育吗？（因为我其他流式抗体，说明书上说冰上避光15-20min即可，相对免疫组化孵育时间很短，是因为流式很敏感只需结合一点抗体就行呢，还是说针对流式的抗体结合效率很高呢？）

fdgg012345

查了一下，好像做流式时抗体的浓度比免疫组化要高许多，难道流式是需要高浓度短时间吗？

niwanmao

fdgg012345 发表于 2014-8-2 13:25
查了一下，好像做流式时抗体的浓度比免疫组化要高许多，难道流式是需要高浓度短时间吗？ ...

我觉得可能跟染色条件有关，流式的标本都是活细胞悬浮在那里的，需要较高浓度渗透，而免疫组化的标本都预先经过福尔马林等固定过，细胞平铺在那里，容易染上。不管如何，不能因此而说流式敏感性差。
流式可以检测数万甚至数百万细胞，效率绝非免疫组化能比，并且特异性高。至于流式的染色条件，只要你的抗体质量过关、标本状态好，一般15－30分钟常温足够。

fdgg012345

niwanmao 发表于 2014-8-3 18:31
我觉得可能跟染色条件有关，流式的标本都是活细胞悬浮在那里的，需要较高浓度渗透，而免疫组化的标本都预 ...

好的，谢谢老师，我换成浓度高一点的再试试。

fdgg012345

niwanmao 发表于 2014-8-3 18:31
我觉得可能跟染色条件有关，流式的标本都是活细胞悬浮在那里的，需要较高浓度渗透，而免疫组化的标本都预 ...

倪老师，下面是我的图片，第一张是同型对照，给它设了一个门，网上看到说控制阳性细胞2%以下就行，请问这样可以吗，是否需要再往右上一点？
第二张是实验组的图，按之前的十字门，细胞在中间被分成了四份，但自身没有分群的迹象，感觉是被人为分开的，这种情况是不是有问题，我需要做单染组来设门吗？

X.同型对照

E.实验组

niwanmao

fdgg012345 发表于 2014-8-3 20:01
好的，谢谢老师，我换成浓度高一点的再试试。

有关抗体滴定请参考以下两个帖子：
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2484-1-1.html

http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html

niwanmao

fdgg012345 发表于 2014-8-3 20:18
倪老师，下面是我的图片，第一张是同型对照，给它设了一个门，网上看到说控制阳性细胞2%以下就行，请问这 ...

做一个单染试试，另外，抗体的浓度也会影响到非特异性荧光的强度，过高、过低均不好。

cocoa

niwanmao 发表于 2014-8-3 18:31
我觉得可能跟染色条件有关，流式的标本都是活细胞悬浮在那里的，需要较高浓度渗透，而免疫组化的标本都预 ...

老师，想问下，就是做胞内蛋白流式检测我是全程冰盒操作的，怕蛋白降解，这种情况是不是不能在室温孵育了？如果在4度孵育时间多长为宜呢？

niwanmao

cocoa 发表于 2019-9-9 16:50
老师，想问下，就是做胞内蛋白流式检测我是全程冰盒操作的，怕蛋白降解，这种情况是不是不能在室温孵育了 ...

30分钟足够。

cocoa

niwanmao 发表于 2019-9-9 21:02
30分钟足够。

谢谢老师，的确是够的，今天染的很成功