细胞超声裂解后用流式细胞术定量检测自噬

niwanmao

自噬是一种细胞蛋白和细胞器在溶酶体中降解的动态过程。目前检测自噬的方法包括显微镜下计数细胞内自噬囊泡（AVS）的数量。
在本文中，作者发明了一种叫OFACS（细胞超声处理后的细胞器流式检测）方法，使细胞经过快速超声裂解后，形成均匀的细胞匀浆，但自噬囊泡仍能保持其荧光标记（经光镜、电镜鉴定AV囊泡保持完整）。
具体步骤如下：

• 细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养，并经药物处理，加入AO染料。
• 细胞用3×1s的频率进行超声裂解，湿度75％。也可以用28 G 1/2的胰岛素针头反复抽吸细胞，可产生类似的效果，不过超声裂解更简单、更可靠、重复性更好。
• 细胞匀浆在室温或4℃下上机。
  

分析时，首先通过FSC/SSC圈出亚细胞群体（见图1），然后特异的自噬囊泡可通过特定的荧光通道圈出（图2），并与对应的细胞数量、微球进行校准计数。

图1

图1

图2

图2


该方法已在以下细胞株中验证通过： PC3, LNCaP, HEK293, U87, MEF, 537MEL, BT474, SKBR3, ZR-75, MCF7, SKMEL23, MALME3, MALME3M and HME (American Type Culture Collection).

PLoS One. 2014 Jan 29;9(1):e87707.
Novel quantitative autophagy analysis by organelle flow cytometry after cell sonication.

Degtyarev M(1), Reichelt M(2), Lin K(1).

Author information:
(1)Department of Translational Oncology, Genentech, South San Francisco, California, United States of America.
(2)Department of Pathology, Genentech, South San Francisco, California, United States of America.

全文：http://www.plosone.org/article/i ... ournal.pone.0087707

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