转染后细胞带GFP荧光，想做凋亡怎么选荧光？

viviwzw · 发表于 2014-9-18 08:51:40

本帖最后由 viviwzw 于 2014-9-18 08:53 编辑

想看转染细胞加药后的凋亡变化
一般凋亡用FITC/PI,但转染后细胞自带GFP绿色荧光重叠了FITC，所以想换成APC/PI，绿色荧光对PI的影响想通过补偿调掉

但还有个问题是转染后每管细胞自带的荧光强度不一样，对PI的影响会强弱不同，每管不能调到相同的本底，这样我是不是要把PI也换掉？换成7-AAD？
不知道我这样的思路对不对，麻烦老师指教~

燕仔zoe · 发表于 2014-9-18 10:05:02

转染细胞GFP怕影响AnnexinⅤ-FITC的检测，可以使用另一种同一类型的凋亡试剂盒AnnexinⅤ-PE/7-AAD。效果是一样的。就是检测的时候，分别作三组单标管，调补偿。

viviwzw · 发表于 2014-9-18 15:07:29

燕仔zoe 发表于 2014-9-18 10:05
转染细胞GFP怕影响AnnexinⅤ-FITC的检测，可以使用另一种同一类型的凋亡试剂盒AnnexinⅤ-PE/7-AAD。效果是 ...

GFP的荧光是不是对PE也有影响？FITC跟PE有交叠，GFP荧光跟FITC几乎是一样的

viviwzw · 发表于 2014-9-18 15:13:59

燕仔zoe 发表于 2014-9-18 10:05
转染细胞GFP怕影响AnnexinⅤ-FITC的检测，可以使用另一种同一类型的凋亡试剂盒AnnexinⅤ-PE/7-AAD。效果是 ...

如果想通过调补偿把GFP对PE的影响消除掉，但转染后每管细胞带的荧光强度不一样，怎样才能调到一个统一的标准呢？

niwanmao · 发表于 2014-9-18 18:59:59

强弱对补偿不会有影响的，用最强GFP的那管调节漏到PI通道的补偿即可。

viviwzw · 发表于 2014-9-19 09:38:50

niwanmao 发表于 2014-9-18 18:59
强弱对补偿不会有影响的，用最强GFP的那管调节漏到PI通道的补偿即可。

那就是说用APC-PI是可以的，GFP跟APC没影响，跟PI的影响可以通过补偿调掉

GFP的强弱没关系是因为光谱是固定的，所以两种荧光之间交叠的比例是固定的，而不是随光的强弱变化

我这样理解对吗？可能我之前没想通这点，看来流式要学习的还很多

viviwzw · 发表于 2014-9-19 12:22:27

niwanmao 发表于 2014-9-18 18:59
强弱对补偿不会有影响的，用最强GFP的那管调节漏到PI通道的补偿即可。

再想问下倪老师，这个实验怎么设计，拿什么当空白？要不要单标PI?如果要的话转染后都带GFP的，是要拿未转染的细胞来做单标PI吗？

niwanmao · 发表于 2014-9-19 18:37:33

viviwzw 发表于 2014-9-19 12:22
再想问下倪老师，这个实验怎么设计，拿什么当空白？要不要单标PI?如果要的话转染后都带GFP的，是要拿未转 ...

你只要拿一个未转染的细胞调节电压，然后用转染GFP的细胞调节FL2-FL1补偿，而FL1-FL2的补偿一般在1％左右，就不需要做了，直接上实验管。

一叶竹23 · 发表于 2014-11-20 15:06:00

倪老师，您好，我想问一下我是在ZF4细胞系中共转了A基因+EGFP，以及单转了EGFP，我选用的是annexin-pe/7AAD试剂盒，先用WT细胞调节电压，要怎样设计光补偿啊？还有就是对于两组不同的转基因细胞需要每组都做PE/-,7AAD/-单阳性，还是只要做一组就好了？

niwanmao · 发表于 2014-11-20 19:45:13

一叶竹23 发表于 2014-11-20 15:06
倪老师，您好，我想问一下我是在ZF4细胞系中共转了A基因+EGFP，以及单转了EGFP，我选用的是annexin-pe/7AAD ...

调节补偿只要做一组就可以。PS：新问题建议开新帖，谢谢。

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