【推荐】流式细胞术最新进展：血液和肿瘤方面的新应用

niwanmao

概述
自从Mack Fulwyler在1965年发明了现代流式细胞仪，流式细胞术现在已经广泛应用于临床和基础科研。流式细胞术可快速同时分析单个细胞的多个指标。计算机技术和光学技术的发展，使得现在可以同时定量或定性检测单个细胞20余个指标，包括细胞大小、胞浆颗粒、核酸含量、各类胞内/胞膜蛋白。这里我们对流式细胞仪基本原理及其在临床和基础研究中的应用做一个综述。

流式细胞术可检测物理学参数（如细胞大小和胞内颗粒度）以及各类荧光标记的抗体，它每秒可利用鞘液流、光学系统、信号检测器分析数千个颗粒/细胞。在流式细胞仪内，有四个主要组成部分：鞘液（形成单个细胞液流）、激发光源（多个激光器）、收集信号的光学滤镜（允许一定波长的光透过并被检测）、信号检测器（将收集到的电子信号转换成数字信号，以定量或定性方式显示）（见图1）。

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流式MRD检测在急性淋巴细胞白血病中的临床意义

定义MRD阳性的截断值（cut-off）通常为骨髓单个核细胞的0.01％。这个值是基于常规流式细胞术和分子学分析的灵敏度而定义的，并且可区分不同复发风险的患者。在最近一项402例B-ALL患者的研究中，183例（45.5％）患者对治疗反应良好，在19天治疗后，MRD值均<0.01％，用最少抗体简化的流式MRD检测可有效检测到治疗15~26天的残留白血病细胞，在此研究中，B-ALL的MRD是在对CD19+淋巴细胞设门后，再根据CD19+细胞中表达CD10或CD34比例来评估的。在84例统一方案治疗的患儿中，19天MRD>0.01％者，10年复发或未缓解率28.8％，而<0.01％者（42例），则仅为4.8％。

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流式在DNA分析中的应用

有些荧光染料可进入核内与核酸结合，从而可在单细胞水平检测成千上万细胞的DNA含量，进而可分析细胞的倍体、细胞周期，对于癌症诊断、网织细胞、血小板计数等都非常有用。
可用的荧光染料有：碘化丙碇（PI）、DAPI（DNA特异性染料）、DRAQ5（Vybrant DyeCycle复合物的一种，对于活细胞也可以用Hoechst 33342）、噻唑橙（RNA特异性染料）。

染料发出的荧光信号与核内DNA含量直接相关，与正常DNA含量（2n）的细胞相比，可发现目标细胞的DNA含量变化。生殖细胞中的染色体数量是单倍体（n），体细胞的染色体数量则是二倍体（2n），偶尔可在一些体细胞中发现4倍体（4n）或8倍体（8n）。肿瘤细胞的染色体数量通常是超二倍体（>2n），偶尔可见到亚二倍体。染色体数量的异常叫做异倍体，反映了DNA含量的变化（见图3）。

图3

通常，DNA异倍体与许多癌症的预后差相关，但在儿童的横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤和急性淋巴细胞白血病（ALL）却是提示预后好的。ALL的超二倍体提示预后好，但多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征的亚二倍体则提示预后差。

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在血液恶性肿瘤中的应用

白血病/淋巴瘤的诊断和分类
一般情况下，外周血或骨髓中出现原始细胞或不典型淋巴细胞、淋巴结肿大，伴严重贫血，往往需要做流式细胞术检测。白血病和淋巴瘤的流式细胞术检测应该是和形态学检查一起成为第一步的检查项目（图4），因为流式可以明确原始细胞的存在，并且确定其系列来源（如原始髓系细胞或原始淋巴细胞），根据其表型，可进一步划分为单核系、巨核系、红系或B淋巴、T淋巴来源。

图4

如果细胞非常原始、分化差，可划分为未分化或混合型，需要继续做生化和病理组化辅助诊断。（见AML的WHO 2008分类）
尽管血液恶性肿瘤的分子学和基因学特点研究得到了很大的进展，但形态学和免疫学分析仍是目前首要的诊断手段。而且，免疫学和一些特定基因异常之间存在一定的关联，免疫学特点可预测临床预后和帮助确定治疗方案。异常细胞初发时的免疫表型异常，可作为治疗后残留白血病检测的有力指标（图4）。对于以上的意义，我们举个例子，例如一例急性髓细胞白血病（AML）缺乏CD34和HLA-DR，这时，我们就得考虑是否急性早幼粒细胞白血病可能，那么进一步做FISH检测t(15;17)，做PML-RARα检测，并在临床上观察是否出现弥漫性血管内凝血。CD56约表达在20％的APL患者中，提示预后差。伴t(8;21)的AML往往表现为CD34、HLA-DR、MPO、CD13高表达和CD33的弱表达。AML伴CD19、cyCD79a、CD56表达可能提示预后差。AML伴NPM1突变而不伴FLT3-ITD通常提示预后好。伴CEBPA^Mut/Mut的AML免疫表型常为：CD7+, CD13+, CD15+, CD33+, CD34+, HLA-DR+, CD14-，提示预后好。

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在白血病/淋巴瘤治疗中的应用

CD20表达在正常和恶性的B淋巴细胞表面，美罗华是针对CD20的基因工程改造的嵌合单抗。CD20约表达在>90％的B细胞NHL和浆细胞上。因为非霍奇金淋巴瘤（NHL）对美罗华的治疗反应可能相差甚大，所以明确药物敏感性对于选择治疗方法很重要，可通过平均荧光强度来明确CD20在选择的B淋巴细胞上是否表达。CD20表达率越高，那么美罗华治疗效果越好。

CLL（慢性淋巴细胞白血病）临床病程各异，有些病人无需治疗就存活数十年，而有些则快速进展，治疗后强化疗也只能存活数年。两组平均生存时间大约是25年和8年，提示是两组临床上不同的实体。了解病人属于哪一组，对于临床上的治疗和随访非常重要，其中最重要的一个指标是免疫球蛋白重链可变区（IgVH）的突变情况，无突变则病程进展快。但IgVH基因的突变检测很复杂，为此，现在找到了一个zeta相关蛋白70（ZAP-70）与IgVH基因突变密切相关，ZAP-70表达阳性，则提示疾病进展快，需要进一步检测CD38和IgVH突变明确。

此外，皮肤T细胞淋巴瘤的CD25（IL-2受体）表达水平对于是否选择Denileukin diftitox（一种IL-2和白喉毒素相结合的工程蛋白）治疗非常重要，CD52则决定着复发CLL是否适合用阿仑单抗（针对CD52的人源化单抗）治疗。

Stanford的Nolan研究组通过检测细胞活化状态/磷酸化，从而预测患者是否对治疗敏感，他们分别检测6个蛋白(Stat1, Stat3, Stat5, Stat6, p38 , Erk1/2)的基础磷酸化水平以及用FLT-3、GM-CSF、G-CSF、IL-3、IFN-gamma诱导后的磷酸化水平，共检测了300例患者的滤泡淋巴瘤细胞以及浸润的淋巴细胞，发现多条信号转导途径的同时分析可反映单细胞水平对药物或刺激的反应，对于理解肿瘤发生机制和治疗指导提供有力支持。
与基因改变相比，流式细胞术的优点是可以使特定亚群的蛋白网络、信号途径活化可视化，最终可以生成细胞功能和药物治疗的整体印象，所以这个领域可能会为流式细胞术在医药方面的发展方向。

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残留白血病和流式细胞术

ALL和AML治疗后微小残留病灶（MRD）是一个非常重要的预后指标。
AML当前的治疗策略中诱导化疗目标就是使形态学上骨髓中原始髓系细胞<5％，至于诱导之后是巩固治疗还是进行干细胞移植，则根据疾病风险而定。干细胞移植并不能确保疾病的治愈，反而有时还存在很大的致病率和死亡率。诱导后治疗中疗效的监测，曾引进不少预后指标，不过，在35％以上遗传学提示预后良好的AML患者均出现AML复发，因此需要有更精确的指标来预测疾病进程和指导缓解后治疗。
在ALL中，MRD监测已广泛应用于大多数儿童ALL和许多成人ALL中，对于个性化治疗十分有用，微小残留白血病细胞的定量还可评估疾病缓解后肿瘤负荷，从而指导后续的治疗。

检测MRD的方法有PCR和流式细胞术，前者采用一些特异性融合基因转录产物或突变、过表达的基因来检测，后者则利用白血病相关免疫表型（LAIP）来检测。LAIP指的是正常骨髓中不存在或少见的抗原表达组合和/或流式物理特性异常，包括：抗原不同步表达（如早期和晚期抗原同时表达）、跨系抗原表达、系列特异性抗原过表达或缺失。流式细胞术的进展使得多色流式能同时检测白血病细胞表面5个以上抗原，根据抗体组合和LAIP数量，检测灵敏度达1/1000~10000个有核细胞。

ALL细胞表达的表面标记能够清楚地提示其B或T的来源，流式能够检测到这些标记并监测治疗过程中的MRD。例如T-ALL表达早期T祖细胞和胸腺细胞的表型（CD3+/Tdt+/±CD5+）。这些免疫表型特征亦可表达在正常发育的胸腺细胞上，但在骨髓和外周血中则可就是LAIP。有些表面抗原表达在正常淋巴细胞发育过程中出现，但在白血病细胞上呈不同步表达。因此，在B-ALL中，常用CD9/CD10/CD19/CD20/CD34/CD45组合。

与ALL不同的是，AML的LAIP变化多端，常常会在一个病例中发现多种LAIP，这就提示这些病例在复发时可能会发生与初发不同的抗原，即抗原漂移。例如Baer等人使用9组3抗体组合检测了136名患者诊断和复发时的免疫表型，发生90％患者白血病细胞发生表型变化。而且AML检测的抗体组合还需要标准化。为此，欧洲白血病协作组发布了一系列检测骨髓髓系分化的免疫标记组合。尽管白血病细胞在复发时会发生免疫表型漂移，而且不同实验室采用的抗体组合不同，但如果初发时采用详细的方案，化疗后即使检测不到原来的某些标记，还是可以检测到一些保留的异常标记和新出现的异常标记。

对于多发性骨髓瘤的MRD研究发现，可以使用CD138/CD45/CD38/CD19/CD56/CD27六色方案检测，最低能检测到0.01%的CD19 - /CD56 + /CD27 weak /CD45 weak骨髓瘤细胞。作者发现自体移植后100天MRD可预测多发性骨髓瘤患者的整体预后。

CLL的MRD可独立反映患者的整体生存时间和无病生存期。EuroFlow协作组最近发布了标准化的八色免疫分型方案和软件，检测骨髓和外周血。不过融入临床实践和MRD检测仍需时间（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2023-1-1.html）。

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急性髓细胞白血病的MRD

尽管目前对于AML的MRD方案不统一，并且在治疗过程中AML细胞会发生抗原偏移，但对AML进行MRD检测，还是有利于风险分层和指导巩固治疗的。
Venditti等人报道在诱导治疗后进行自体移植或序贯巩固治疗的患者中，巩固治疗后MRD水平在3.5*10E-4（万分之3.5）或更高时，提示整体生存率和无复发生存率低。该小组还报道巩固后MRD可预测自体干细胞移植的预后。所有高危患者（12/12）中位生存时间为7个月，而低危组（共19例），有5例平均在11个月后复发，14例持续56个月缓解(p = 0.00004)。

Buccisano等人也确认了多参数流式细胞术检测MRD时3.5*10E-4（万分之3.5）水平对以后有提示意义，在100例AML患者中，巩固后MRD状态比诱导后MRD状态、核型等指标能够更真实地反映出疾病预后、复发率、整体生存率、无复发生存率。

对未经选择的AML患者进行独立分析发现，用精细组合的抗体方案检测时，那些诱导治疗和巩固治疗后缓解的患者，只有巩固后MRD才是与整体生存率密切相关的唯一指标。

移植前MRD也会影响造血干细胞移植预后。

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体内流式细胞术及其在肿瘤生物学中的应用

尽管流式技术获得了长足进展，但常规的体外流式细胞术存在许多不足之处。 从体内取出细胞进行分析，可使得细胞特性的改变，使得无法分析细胞本来的生物学特征（例如细胞与细胞之间的作用或代谢）。 不同时间点采取样本进行分析，既费时，又可能因采样体积限制和不连贯导致稀有事件检测的敏感度降低。 相反，体内流式细胞术就可以持续监测某个指标，从而避免上述缺陷，并为理解疾病生物学和许多疾病（如癌症、血液疾病、感染等）的早期诊断提供新的视角。

体内流式细胞术可呈现出流动的血液或淋巴液中单个细胞的特征，而不是在常规流式细胞术的鞘液中。 体内流式细胞术中，激光可诱发独特的物理学特征，然后通过对应的技术方法（例如荧光、光声、光热等）检测到。 利用多光子荧光技术检测荧光 多光子荧光采用脉冲性长波长光来激发荧光分子，使得组织中散射光最小化，并抑制背景信号。 这项技术可增加活体器官深层组织的光透射能力，并且光毒性非常小。 多光子流式细胞术的特点和优点，Tkaczyk等人已经讨论得非常详细（Tkaczyk ER, Tkaczyk AH. Multiphoton flow cytometry strategies and applications. Cytometry A 79(10), 775–788 (2011).） 例如，多光子流式细胞术可检测外周血中稀有的循环肿瘤细胞（CTCs）。 对于这类稀有肿瘤细胞，目前可用的工具非常少。 目前的诊断性影像方法包括CT、磁共振、PET-CT等只能检测到2-3mm的转移灶。

体内流式细胞术能够直接检测外周血管中的荧光标记细胞，故可克服采样限制，能够检测到极其稀有的事件（<1 CTC/ml外周血）。 飞秒级的钛宝石激光用来进行双光子激发，然后用x40 IR水浸物镜收集荧光，并经过HQ 520nm/40nm带通滤镜过滤FITC和600nm/65nm滤镜过滤罗丹明。 M109小鼠肺癌细胞 皮下注入BALB/c小鼠背部，叶酸罗丹明通过尾静脉注入进行体内标记。 注入2周后，通过耳朵的血管能够检测到1.4个CTC/分钟，并且随着肿瘤生长，检测到的CTC数量越来越多，但直到4周时才能观察到肉眼可见的转移灶。

基于荧光的体内流式细胞术还是有其它缺陷的，例如荧光素毒性、连续波长激光的强度过高、深层组织的分辨率不足。 光声流式细胞术则在这些方面有一定的优势，这种技术将激光能力转换为热和伴随的声学效应，而不会产生辐射性伤害。 在光声流式细胞术中，血流中的目标细胞暴露于激光中，激光诱导的光声波可被皮肤表面的超声探头检测到。 多路复合光声流式细胞术可同时检测单个细胞多种特征。 双色纳米颗粒靶向结合的循环肿瘤细胞可被波长为639nm和900nm的激光激发检测，延迟大约为10ms。 为了体内标记肿瘤细胞，磁性纳米颗粒与尿素激酶型胞浆素原活化子的氨基末端结合，后者在639nm波长下可作为双磁性和光声造影剂。 如果再增加一个光声造影剂，可增加敏感性和特异性。  金碳纳米管特异性结合肿瘤细胞的叶酸杀体，在900nm下是高效的光声造影剂。 在MDA MB231移植模型1周后，作者注入这两种光声造影剂，8~10分钟就可以检测到639nm和900nm的光声信号。 这样，在淋巴结转移显性病灶出现前，淋巴结中就已经可以检测到乳腺癌细胞了。

体内光声流式细胞术亦在黑色素瘤小鼠外周血和淋巴管中检测无标记的单个黑色素瘤CTC中表现出了极佳的能力。 同样的研究小组采用高脉冲频率的掺镱的纤维激光（50mJ，1064nm）和增强的纳米造影剂。 这种系统表现出了更高的敏感性和特异性。 在注入B16F10黑色素瘤的小鼠中，微循环和腹壁血管中在注入4天后就可检测到黑色素瘤细胞。 腹壁血管中的循环肿瘤细胞数量比耳朵中更多，提示光声流式细胞术在监测快速移动的循环肿瘤细胞时，大血管中相对容易检测。

以上提到的方法均在血管CTC检测中表现不俗。 然而，这些方法只能检测外周小血管。 而且，这些方法无法长时间监测这些稀有事件，持续固定或麻醉使动物保持一个固定位置也不容易。 因此，有人开发了更敏感和创伤更小的纤维光学探头，以检测深部大血管高速血流。 Chang 等人 用此监测了MCA-207小鼠肉瘤细胞的动态变化以及血管循环肿瘤细胞的长期变化。 纤维探头在血流中检测表达GFP+细胞时敏感性非常高。 此研究使用了双通道、双光子纤维荧光探头

这些体内实验的检测效率为注入细胞总数的27％。 随着标记技术的发展（如单克隆抗体或纳米颗粒），能检测大血管、长时间监测多荧光分子的体内流式细胞术会逐渐应用到临床上。 体内流式细胞术的应用慢慢开展扩展到许多领域和疾病中。 体内流式细胞术在医药上的应用已经成为非常活跃的领域。 然而，这项技术的临床标准化及其临床价值还需要进一步研究。

关于体内流式细胞术更详细的介绍，参见In Vivo Flow Cytometry: A Horizon of Opportunities
下载：
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附图：

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专家评论

流式细胞术是一项强大的工具，可在数秒内分析成千上万个细胞，获取这些细胞的许多特征，提供重要的诊断信息。尽管血液肿瘤的分子和基因特点研究越来越深入，但形态学和免疫学仍然是诊断的首要依据。恶性细胞的特异性免疫特征，可用来诊断、评估治疗反应、检测MRD。微小残留白血病细胞的定量能够评估诱导治疗后肿瘤细胞负荷，预测疾病预后，也可以指导后续治疗（如调节化疗药物剂量或早期干细胞移植）。MRD的检测现在已经成为大部分ALL和AML患者的标准化检测，但MRD检测还可以拓展到多发性骨髓瘤和CLL。最近，欧洲Leukemia NET和EuroFlow协作组分别发表了分析骨髓、外周血中正常和恶性白细胞的标准化八色方案和软件工具。

体内流式细胞术的研发，是为了克服采样误差和体外处理时生理学特性的改变。多光子细胞术、光声、光热方法的最新进展，结合增强的纳米颗粒显影剂，以及最小侵入性的纤维光学探头，使得检测小鼠模型肿瘤发生转移灶前血液和淋巴管中循环肿瘤细胞成为可能。体内流式细胞术能早期检测出稀有的循环肿瘤细胞，为实体肿瘤的早期干预提供依据，从而提高患者预后。
除了表面抗原的免疫表型分析，流式细胞术还可分析胞内抗原，例如DNA、细胞因子、磷酸化信号蛋白等。

因此，流式的应用能够实现功能性分析，帮助建立分层性的治疗策略，预测治疗反应。而且，更廉价和更强大的仪器问世，能够进一步帮助疾病诊断和影响临床治疗。

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未来五年流式发展前景

单克隆抗体、光学、计算机技术的发展，对流式的创新产生巨大影响，使得流式的应用范围越来越广，使用越来越方便。流式细胞术目前应用在大量的领域，尤其是血液学和肿瘤学（区分特定的血细胞群和诊断白细胞、血小板、红细胞减少的类型，以及诊断白血病、淋巴瘤）。在本文连载前面几个部分中，我们还讨论了MRD检测及体内流式细胞术。
现在最重要的一步，就是对每一种应用进行标准化，以促进临床应用的便利性和可重复性。这里的标准化包括抗体组合、实验室处理和分析步骤。现在已经有多个欧洲组织做了这方面的努力和尝试，这些标准化的实验方案有助于使临床流式细胞术提升为血液疾病诊断的重要而通用的工具。

体内流式细胞术的大部分应用还是在动物模型上，然而，尽管有理论上的支持和动物模型的验证，目前还是没有对各类肿瘤患者检测循环肿瘤细胞的临床验证。因为对于体内流式细胞术，目前还需要明确四个问题：
1、在临床上，体内流式细胞术检测循环肿瘤细胞是否能做到高度可重复性？
2、检测到循环肿瘤细胞是否真的能够在影像学出现明显病灶前提示早期微观病变？
3、如果第2个问题能确定早期微观病变，那么是否需要马上进行化疗或生物学治疗？
4、体内流式细胞术的早期检测是否能转化为患者预后的改善？

当体内流式细胞术在临床上逐渐应用开来后，就需要设计规范的临床试验来回答这些问题。


激光、荧光素、量子点染料和计算机处理软件的快速发展，促进了现在最先进的18色流式细胞术。然而，基于荧光的流式细胞术，所能够使用的荧光数量，被荧光之间的光谱重叠大大限制。为了克服此缺陷，出现了一种结合流式细胞术和质谱的新平台，叫质谱细胞术，使用同位素结合的抗体标记细胞，细胞被原子化和离子化，然后质谱细胞术会检测重金属，而不是常规流式中的荧光标记抗体。质谱细胞术可检测至少40个指标，理论上可同时检测70~100个参数。第一台商业化质谱细胞仪叫CyTOF，现在已经在销售。质谱细胞术的灵敏性和输出较低，但分辨率和同时检测的参数较多。不过，随着量子点（quantum dots）的出现，QD可作为报告染料、商业化螯合聚合物，在抗体上结合更多的金属原子，并且质谱细胞仪仪器性能的改进，均可使得质谱细胞术的灵敏性和输出得到提高。这项技术问世时间不长，还未在临床上开始应用。

未来五年，质谱细胞术和荧光流式细胞术有望得到继续发展，流式的应用会越来越便利和可靠，使得临床上对于各种疾病的机理研究更为透彻，通过诊断精确性的提高、治疗效果的监测、疾病早期干预，进一步提高患者预后。