两次重复实验结果的差异

yzz123322

倪老师你好， 今天做了1个正常人的外周血，上午做完后，没分析，下午回来后发现结果看起来很不好，群体分的很散。所以下午重新做了一次，用的是上午剩的血，这次结果就好很多。请问是为什么啊 谢谢。附件挺多的 @niwanmao

niwanmao

晕啊，下载了半天全部下载完，结果说压缩包错误。
你其实不用上传这么多的，只要上午传一个FCS文件，下午传一个同样标记的文件，只要这两个就行了。

yzz123322

niwanmao 发表于 2014-11-14 22:54
晕啊，下载了半天全部下载完，结果说压缩包错误。
你其实不用上传这么多的，只要上午传一个FCS文件，下午传 ...

好的  郁闷

yzz123322

看看 这次成不？ 谢谢

yzz123322

niwanmao 发表于 2014-11-14 22:54
晕啊，下载了半天全部下载完，结果说压缩包错误。
你其实不用上传这么多的，只要上午传一个FCS文件，下午传 ...

顺路问一个问题， flowjo 能比较2个象限门的比值吗？ 比方说CD4和CD8的比率。昨天试了下，添加统计， 设置好后， 值显示n/a

niwanmao

yzz123322 发表于 2014-11-15 08:58
顺路问一个问题， flowjo 能比较2个象限门的比值吗？ 比方说CD4和CD8的比率。昨天试了下，添加统计， 设 ...

分析了下，我明白你说的意思了，Qian这个标本是上午做的，Lujun这个标本是下午做了，Lujun的CD8分群特别集中，是这个意思吗？
那么你有没有比较过同一个标本，上午和下午染色的区别呢？

阳性细胞群是否集中，和很多因素有关：
1、抗体滴度；
2、细胞密度；
3、液路是否干净；
4、标本是否存放过久
5、其它未知因素

所以，建议你从以上方面逐个排除原因。
至于获取的细胞数量，我建议你对于这种比例高的细胞，只要取1万个细胞即可，没有必要获取30万，太多了，自己分析麻烦，传个文件也累。FLOWJO中让它自动计算CD4/CD8的比例，我平时用的少，也不知道怎么设置。

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minazeng

niwanmao 发表于 2014-11-15 15:28
分析了下，我明白你说的意思了，Qian这个标本是上午做的，Lujun这个标本是下午做了，Lujun的CD8分群特别集 ...

倪老师，那如果用免疫表型检测细胞及其数量时，需要做复孔吗？我感觉文献中都没有写复孔，是不是因为流式稳定性较好，每个标本只需要测一次即可？另外，我也发现调好的补偿和设门，不同的标本还是会有点不同，不同标本的同一群细胞会有点移位，应该怎么解决呢？难道每次上样都要重新设门吗？可是分析数据好像是需要相同的补偿和设门条件的对吧？

小憨

我自己也有相似经历。有的时候标本处理的很小心，操作很轻柔，操作时注意冰上放置标本、避光等，但是还不如随便做做的结果漂亮（“漂亮”指的是分群良好，散点图上的细胞“团”集中）。后来我读了咱们网站上有一篇文章是关于环境条件对流式细胞仪的影响，它上面说了一个影响因素令我印象还挺深的就是温度，如果室温查几度流式图变化很大，所以后来我都注意这些条件，上机前提前半小时就把空调打开。另外开机以后我会直接先跑10 min的水，让激光管和PMT充分预热后再检测我的样本，样本检测最好是对照、实验、对照、实验……这种顺序测，最好不要先把对照都测了，再把实验组测了。

zj8237277

倪老师，那如果用免疫表型检测细胞及其数量时，需要做复孔吗？我感觉文献中都没有写复孔，是不是因为流式稳定性较好，每个标本只需要测一次即可？另外，我也发现调好的补偿和设门，不同的标本还是会有点不同，不同标本的同一群细胞会有点移位，应该怎么解决呢？难道每次上样都要重新设门吗？可是分析数据好像是需要相同的补偿和设门条件的对吧？

倪老师，同问，还请帮解答下。谢谢！

niwanmao

minazeng 发表于 2017-6-29 07:52
倪老师，那如果用免疫表型检测细胞及其数量时，需要做复孔吗？我感觉文献中都没有写复孔，是不是因为流式 ...

@minazeng  @zj8237277

流式不需要复孔，那是ELISA的理念。你所谓的不同次差异，我怀疑是以下原因：
1、细胞数量未足，如果只取1000个细胞，阳性区相差10个细胞就相差1％，如果能够获取10万个细胞，那么即使相差100个细胞，比例上也只是相差0.1％，对比例不会造成足够影响。
2、液路不稳定。如果仪器状态不稳定，那么不同次之间结果会有较大差异，此时，可通过FSC/Time双参数图看一下。
3、其它：样本稳定性、标记步骤的稳定性，这些涉及到质量控制了。