影响样品荧光标记的因素

niwanmao

定量细胞学的荧光染色易受多种因素影响，以至导致不正确的实验结果。其主要因素如下：
⑴ 温度的影响：
在一般情况下，荧光染色的环境温度对结果有明显影响。因为温度升高，可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子动力加大，使荧光猝灭（随荧光染料浓度增加，荧光分子被邻近分子所吸收而荧光量子产额降低的一种现象）的可能性也随之加大，这就使荧光分子和其它分子之间相互碰撞机率明显增加；因此影响了荧光分子发光量子的产额。温度升高时，荧光量减弱。一般在20℃以下，荧光分子发光产额的变化不明显，基本保持恒定。


⑵ pH值的影响：
荧光分子在溶剂中基本上处于离子化状态。因此，溶剂中的氢离子浓度对荧光强度的影响是极大的。荧光染料发光最好条件是在溶剂中处于离子化或极化状态。
每一种荧光染料分子发光量的产额最高时均有最适pH 值，以保持荧光分子与溶剂间的电离平衡。如果pH 值发生改变，可能造成荧光光谱的改变。也可造成荧光强度的降低。


⑶ 荧光染料浓度的影响：
在荧光染色过程中，必须保证使用的荧光染料浓度与荧光强度呈严格的正相关关系。但是，每种荧光染料在溶液中随浓度增加，其发光功能都存在一种猝
灭现象。这主要是缔合分子的形成，缔合分子本身具有猝灭作用，是因为缔合分子中的电子共振作用，而消耗了激发分子的能量而参与猝灭作用。所以，当溶剂稀释荧光染料分子之间的相互作用完全消失时，荧光量子的产额最大，发射的荧光强度最强；当溶液浓度增加时，荧光分子之间就发生碰撞效应，缩短了电子处于激发状态的时间，使得非辐射跃迁几率增加，从而引起荧光量子产额下降。同时，荧光染料分子浓度过高，也容易产生内滤光效应。所以。
选择合适的荧光染料浓度，对于荧光定量检测技术是十分重要的。

⑷ 杂质对细胞荧光染色的影响：
杂质对荧光的猝灭作用，是由于溶剂中含一些不发光物质。这些物质存在，使荧光分子受光激发后与其它分子相互作用，使荧光分了光量子产额减少而造成猝灭现象；还有些杂质可以与荧光分子结合形成新的化合物，使吸收光谱发生改变，使荧光量子产额降低。


⑸ 细胞固定剂对细胞荧光染色的影响：
一些插入性荧光染料在应用中需要使用一些固定剂时，有些固定剂与细胞某些物质结合，干扰了插入性荧光染料与细胞成分的结合，造成荧光发射强度的改变。如染色细胞DNA 时应用醛类（戊二醛、甲醛等）固定剂，可使荧光强度降低50%左右；而醇类固定剂则相对影响较小。因此，对荧光定量检测中，细胞固定剂的选择也是十分重要的。


⑹ 其它影响因素：
溶剂的性质、浓度对荧光的猝灭也有一定的影响。例如，光神霉素在盐水溶剂中，NaCl 1.9%以上时，对荧光强度有明显影响，0.9-1.8%浓度时，荧光强度相似；<0.9%浓度时，荧光强度减弱。


因此在利用荧光染色技术检测细胞某种成分含量时，为了得到正确的测量值，就必须对能影响荧光强度的众多因素进行严格控制，才能得到满意的结果。