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Morrissey说过：“在生活中，我们在渐渐死亡”。实际上在实验室中，我们每做一个实验，样本中总是会有一些细胞死亡。这在有些检测时可能不重要，但有些检测中则非常麻烦。
为什么死细胞是个问题？
流式细胞术是一个容易被死细胞所干扰的技术，因为：
1. 死细胞容易摄取抗体和探针，导致明显的非特异性染色。
2. 死细胞自发荧光特别强。
所以，最后导致背景荧光增强，使得我们无法观察到一些标记的弱阳性表达。
如果这些还不够糟糕，那么死细胞还可能会释放DNA，而做过分子生物学的同学都知道，DNA非常粘稠，所以最后会导致细胞成团，既影响结果，又容易堵塞管路。在流式分选中，一般都不愿意分选活力不好的细胞。
解决死细胞问题
不管是否害怕死细胞，我们都需要去面对并且解决，即使不是把它们从管子中去除，至少也得在分析时将它们排除掉。
首先，我们需要确保细胞的培养基中含少量DNAse，以保证细胞单个存在，不被死细胞产生的DNA影响而粘附在一起。
其次，我们可以利用死细胞的一些特性来区分它们。当细胞死亡时，它们就会失去膜的完整性，膜的渗透性增强，这就是为什么我们在标记抗体时死细胞容易发生非特异性染色的缘故，但同时，我们也可以利用这个特性来帮助我们鉴别死细胞，目前有两个方法-----使用DNA染料或蛋白染料。
DNA结合染料
诸如PI、DAPI、7-AAD、TO-PRO-3等DNA染料只会进入细胞膜受损的细胞，结合到细胞的DNA上，从而使得检测时能够很容易将死细胞区分开来（见图1A）。一般情况下染色方法非常简单，只需要将适量的DNA染料加入样本中孵育10分钟，马上上机检测就可以了。记住，这个染色时间不能太长，否则其它活细胞容易因染料死亡。
上述染料的激发、发射特性各不相同，相信总有一款适合您。
图1
图1. A图显示的是使用DNA染料（PI）染色，死细胞PI阳性（上方的区域）。 B图显示的是用可固定的胺类结合染料（eFluor780）标记死细胞，同样，死细胞也是在上方区域。
你可能已经注意到了，我们在上面的步骤中是把染料直接加入活细胞标本中。如果我们将PI等加入经过固定的细胞中会怎么样呢？因为固定会使所有的细胞都发生渗透性增高，所以，结果就是所有的细胞都染上PI。在一些需要检测胞内抗原而不得不破膜的标本中，这时就没法用PI等DNA染料来区分死细胞了。
那么，接下来就轮到蛋白染料出场了。。。
蛋白结合染料
蛋白结合染料有时候又被称为胺类反应性染料或live/dead可固定染料。它们也是基于死细胞胞膜受损的原理，但略有不同，它们不是结合到DNA，而是结合到蛋白质，所以这类染料需要在固定前加入样本中。活细胞由于细胞表面有少量蛋白，所以会结合少量的蛋白染料，而死细胞由于染料可以进入细胞内，所以能够结合大量的胞内蛋白质，荧光会特别强。
染色完成之后，细胞就可以用多聚甲醛或乙醇等进行固定了，固定之前的死、活细胞之间的染色水平差异会一直保留着（见图1B）。这种染色方法也非常简单，只需样本和染料直接孵育20分钟，而且这类染料的激发和发射特性也很多，所以也一样总能挑选到一种适合你实验的荧光标记蛋白结合染料。
蛋白结合染料中一些代表性的产品有：live/dead可固定染料、eFluor可固定染料、Horizon染料、Biolegend的Zombie染料和Ghost染料。虽然这些染料是可以用在固定标本中的，但并非强制固定，所以也可以用在分选实验中区分死细胞。
看了以上内容，你明白了流式实验中，没有理由不加活性染料了吧，那么现在就注意使用活性染料区分死细胞，保证你的实验结果吧。
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发表于 2015-1-9 15:16:11
发表于 2015-1-10 13:45:10
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