请教小鼠 FOXP3的问题

zark_00

我用的ebioscience 的F/P 和Permeabilization 液，过夜固定破膜后，用Permeabilization 液洗两遍，小鼠IgG封闭，后直接加foxp3抗体，本来是常温2小时的，结果有事耽误了，孵育了4小时，请问有没有影响，我用fitc CD4和PE FOXP3标记，怎么只有CD4阳性群，没有双阳群呢，一个同事用同样方法做出来过，只是孵育时间是2小时，没我拖得时间长。我用的是荷瘤鼠的脾细胞悬液。。。

zark_00

还有，我脾细胞悬液制备时，用的是1640+10%fbs的培养基，做的研磨，过滤，离心洗涤。到要染表面时，才换的staining buffer 重悬，请问会不会跟悬液制备时有关系

zark_00

还有个可能，会不会我抗体加少了，ebioscience的PE FOXP3 ，推荐时1ug ，5ul， 我用的0.2ug

niwanmao

1、过夜固定破膜？究竟是固定过夜还是破膜过夜？
2、foxP3孵育，时间太长可能不是很好，抗体荧光容易衰减，导致分群不清。
3、如果FSC、SSC显示细胞状况还可以，就不会跟悬液制备有关。建议如果有可能，加一个live/dead染液。
4、foxP3抗体加少了肯定会影响，抗体用量需要做滴定。

zark_00

niwanmao 发表于 2015-1-13 08:55
1、过夜固定破膜？究竟是固定过夜还是破膜过夜？
2、foxP3孵育，时间太长可能不是很好，抗体荧光容易衰减， ...

谢谢倪老师的回复。

1  我用的eBIOSCIENCE 的 Fixation/Permeabilization液 固定破膜4度过液
2 我就室温孵育了4个小时，做出来的同事是2小时。
3抗体确实没滴定，实验就没摸索过，大量做样本得太急。
4荷瘤鼠和正常鼠可能在T细胞这块有有区别。同事用的正常鼠

倪老师能不能提供个亲自使用过的protocol呢

niwanmao

zark_00 发表于 2015-1-13 12:17
谢谢倪老师的回复。

1  我用的eBIOSCIENCE 的 Fixation/Permeabilization液 固定破膜4度过液

我没用过EB的，如果这个成分含破膜剂，那么过夜我认为不合适。以前一个研究生在我这里做过foxP3，也是破膜后过夜，愣是做不出来，后来让她改成固定过夜，第二天早上过来破膜后染色，就出来了。
所以，最好是买那种固定和破膜成份分开的，或者实在不行，你就先用PFA固定过夜，第二天用这个F/P kit破膜。