人人为我，我为人人－－荧光扣除对照（FMO）

niwanmao

你是不是碰到这种情况：做完一个多色流式实验，跑完所有对照，做完补偿，准备分析了，却发现不知道把门放在哪里？


是人都会犯错……

用流式细胞仪获取数据，会存在因为计数统计、数据处理和光电倍增处理等原因引起的测量误差。当进行补偿调节后，这些错误就会显示出来，你会看到调节完补偿后的数据呈弥散状态（见下图）。荧光强度越强，此类测量误差越明显。



你应该意识到这些错误的存在，为了尽量减少数据弥散的出现，你可能需要设计一个更好的实验，或避免那些可能导致图形弥散的通道。不过，首先需要保证你使用了正确的对照，对数据进行了正确的解读。


荧光扣除对照（Fluorescence minus one controls，FMO）

FMO对照现在已普通应用于多色实验，而且是多色实验所必需的。FMO对照是指用同种细胞，染上去掉一种荧光素的其它所有荧光素。这样可以使各种荧光素对未标记通道的渗漏体现出来，使得你能够将门放在合适的位置，因此，是设门所必需的对照。

示例：

FMO

上图显示了FITC和PE的染色，并给出了基于FMO正确区分CD4（PE＋） T细胞群的设门方法。这些图显示出，即使你看不到PE-Cy5和PE-Cy7数据，但通道之间的补偿还是可以看出来这些荧光对PE通道的渗漏。所以，为了对PE＋细胞进行正确设门，需要FMO对照，而不是空白对照。（数据来源：Mario Roederer, NIH Vaccine Centre.）


FMO真的必需吗？

是的，FMO是非常好的对照，你在投稿时会发现越来越多的评审要求你提供这些数据。然而，不是所有通道都需要。FMO对照只是在需要准确区分阳性、阴性时才是非常重要的，例如你要测定的抗原表达很弱、或者呈连续表达。
仔细观察你使用的通道，看看哪个通道需要FMO，也可以第一次把每个通道都应用一次FMO，然后分析后再决定哪个通道值得每次都使用FMO。


黄金原则：记得在实验中使用对照，并且记得每次实验都一起跑FMO对照。

niwanmao

luoying1983121 发表于 2015-12-11 16:29
老师，你好，我最近在做胞内因子IL10的染色，的确觉得设门有些困难。我开始用的是同型对照，按照我们实验室 ...

做胞内因子的FMO对照即可。如果分群不明显，并且背景较高，还是需要同型对照的。

niwanmao

culturelily 发表于 2015-3-30 14:44
请问，如果我用了FMO对照，就可以不用同型对照了

所谓同型对照，就是与目标抗体来源相同的免疫球蛋白，其作用就是为了排除该抗体非特异性结合引起的信号，无法排除其它因素（如荧光渗漏、信号干扰等）引起的非特异性荧光。而目前单克隆抗体的质量越来越好，所以单纯因为抗体非特异性结合引起的背景已经可以忽略，所以FMO的作用更加突出。

如果你是FMO+同型对照更理想，但一般认为是没有必要。

Kimbryant

老师，如果我要测CD4+CD25+FOXP3+上面的tim3,要做几管啊？空白管，CD4单标管，CD4+CD25+FOXP3+管，CD4+CD25+FOXP3+tim3+管？要不要做CD4+CD25+双标管啊

niwanmao

Kimbryant 发表于 2015-1-21 17:19
老师，如果我要测CD4+CD25+FOXP3+上面的tim3,要做几管啊？空白管，CD4单标管，CD4+CD25+FOXP3+管，CD4+CD25 ...

你要圈foxP3阳性的细胞，然后再要分析这类细胞中的TIM3，所以按照道理CD4＋CD25+是需要的。但实际上foxP3目前大多数都是可以分群清楚的，所以不做问题也不大。

culturelily

请问，如果我用了FMO对照，就可以不用同型对照了

culturelily

第一个图里面的C和B的门是根据什么圈出来的？高度如何确定？

niwanmao

culturelily 发表于 2015-3-30 21:58
第一个图里面的C和B的门是根据什么圈出来的？高度如何确定？

C门是阴性区域门，B是最高表达的那群阳性细胞，至于高度，问题不是很大。上面示例中因为C门上面有少量非特异性染色，所以避开了点。

zpmsimpy

楼主您好，请问我如果用单染管 是否也可以起到FMO对照的效果？我的理解是每个单染管也可以看到染色荧光在其他通道的渗漏情况，不知与您的FMO染色方式有何不同？敬请指教！

小憨

倪老师我有个问题：FMO对照可以用beads做吗？

niwanmao

zpmsimpy 发表于 2015-5-11 22:55
楼主您好，请问我如果用单染管 是否也可以起到FMO对照的效果？我的理解是每个单染管也可以看到染色荧光在其 ...

单染看的是这个通道漏到其它通道的荧光有多少，而FMO则看的是其它通道漏到这个通道的荧光有多少，恰恰相反的作用。