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悬赏1流星未解决
一、第一次还可以染上，但是之后再也染不上了，这是何故？
我的步骤：
1.收集PBMC，1200r，5min；
2.PBS洗涤2次，1200r,5min每次；
3.staining buffer 100ul，CD4（FITC），CD8(647)或CD25(RPE)各5ul每孔，室温避光孵育30min；
4.重复2；
5.staining buffer 300ul，上机检测。
二、胞内染色，我的il-4（pe）和IFN-garmma（647）一直染不上，il-17（cyc5.5）和foxp3（647）非特异性染色很高，可达90%以上，有的分群还是很明显，有的不行。
我是cd4，il4，IFN-garmma和il-17一起染,测th1/th2/th17; CD4,CD25和foxp3一起染测treg细胞。
我的胞内染色步骤是：1.胞面染色后，破膜室温避光40min（破膜是可以破胞膜和核膜的），0.5ml/孔；2.破膜buffer洗涤2次，1ml/孔；3.加相应抗体，一般5-8ul每孔，室温避光孵育30min；4.破膜buffer洗涤2次，1ml/孔；5. staing buffer 300ul，上机检测。
三、试剂品牌
抗体：1.CD8(647) CD25(RPE) IFN-garmma（647） il-4（pe）都是 AbD serotec的；
il-17（cyc5.5）是kingfisher biotech的，另外加的染料（innova Biosciences的）。
破膜剂：用的eBioscience的foxp3/transcription Factor staining buffer set. fixation/permeabilization和稀释液用1:3. 破胞膜和核膜全用她。
没有人理我我就放弃了，实在是做不出来啊。
先跪谢了！ |
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发表于 2015-1-25 19:59:25
发表于 2015-1-25 21:02:36