PBMC CD8 CD25染不上，染了几个月了一直染不好，都快崩溃了...

mcdfish

一、第一次还可以染上，但是之后再也染不上了，这是何故？
我的步骤：
1.收集PBMC，1200r，5min；
2.PBS洗涤2次，1200r,5min每次；
3.staining buffer 100ul，CD4（FITC），CD8(647)或CD25(RPE)各5ul每孔，室温避光孵育30min；
4.重复2；
5.staining buffer 300ul，上机检测。
二、胞内染色，我的il-4（pe）和IFN-garmma（647）一直染不上，il-17（cyc5.5）和foxp3（647）非特异性染色很高，可达90%以上，有的分群还是很明显，有的不行。
我是cd4，il4，IFN-garmma和il-17一起染,测th1/th2/th17; CD4,CD25和foxp3一起染测treg细胞。
我的胞内染色步骤是：1.胞面染色后，破膜室温避光40min（破膜是可以破胞膜和核膜的），0.5ml/孔；2.破膜buffer洗涤2次，1ml/孔；3.加相应抗体，一般5-8ul每孔，室温避光孵育30min；4.破膜buffer洗涤2次，1ml/孔；5. staing buffer 300ul，上机检测。
三、试剂品牌
抗体：1.CD8(647) CD25(RPE) IFN-garmma（647） il-4（pe）都是 AbD serotec的；
il-17（cyc5.5）是kingfisher biotech的，另外加的染料（innova Biosciences的）。
破膜剂：用的eBioscience的foxp3/transcription Factor staining buffer set. fixation/permeabilization和稀释液用1:3. 破胞膜和核膜全用她。
没有人理我我就放弃了，实在是做不出来啊。
先跪谢了！

niwanmao

有没有图或原始数据？
建议传上来看看。

mcdfish

这个是我第一次染色cd4 cd8的图。
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzQ4Mnw2Y2E1MGUxNXwxNzE0ODI5ODY3fDB8

mcdfish

这是我后来染cd4 和cd8的图  FITC 是CD4，647是CD8
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzQ4M3w5NWM5M2UzNHwxNzE0ODI5ODY3fDB8

mcdfish

niwanmao 发表于 2015-1-25 21:02
有没有图或原始数据？
建议传上来看看。

我在下面传图，请教下

mcdfish

这两个分别是th1/th2/th17的图和treg的图。谢谢了
Th1/Th2/Th17:
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzQ4NHxjZmJmYjNlYnwxNzE0ODI5ODY3fDB8


Treg:
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzQ4NXxkZDVmNTcxM3wxNzE0ODI5ODY3fDB8

niwanmao

mcdfish 发表于 2015-1-25 21:59
这个是我第一次染色cd4 cd8的图。

看了这么多次结果，感觉你染色的结果很不稳定。

20150113的CD4、CD8分群还不错，但是不知道为什么FSC这么大，而且你有没有试过圈那群FSC偏小的。

20150118的CD8完全没出来，foxP3、IFN-gamma和CD8都是647你确定没有加错抗体？如果同样的抗体，没有理由出不来。

至于最后两管201150107和201150112我就看不懂了，因为你图形上是什么抗体我也不知道。不知道你是用什么软件分析的，为什么不把抗体名称放上去呢？

mcdfish

niwanmao 发表于 2015-1-26 09:08
看了这么多次结果，感觉你染色的结果很不稳定。

20150113的CD4、CD8分群还不错，但是不知道为什么FSC这 ...

倪老师，你好。首先谢谢您的回答。附件是我后来圈的FSC较小的那个门。
后来的几个图：
一个图：先表面染CD4----FITC的，再染胞内ifn-gamma---647，il-4----PRE，il-17----cyc5.5。这几个是一起测定，。
另一个20150107-TREG：先表面染CD4----FITC和CD25-----PE，再染核内foxp3----647。


这个是机器电脑上自带的软件。

https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzU0MXw1NDVjMDFmOHwxNzE0ODI5ODY3fDB8

mcdfish

另外，我确定抗体没有加错。

niwanmao

mcdfish 发表于 2015-1-27 22:01
倪老师，你好。首先谢谢您的回答。附件是我后来圈的FSC较小的那个门。
后来的几个图：
一个图：先表面染CD ...

1、CellQuest是可以在每个通道那里输入抗体名称的，建议以后获取时把抗体名称也写进去，方便自己或其它人分析，这是一个应该有的好习惯。

2、能否把第二次没染上的FCS数据文件压缩一下传上来？