流式细胞术疑难解答（一）：信号弱

niwanmao

如果抗体染色信号弱或无信号，可能是由于以下原因引起的：



1、抗体储存
确保你的抗体保存在4℃并且避光。如果抗体结合了荧光素，那么千万不要冷冻保存，因为这可能会导致荧光抗体的沉淀和聚集。还有，要确保抗体没有过期。

2、稀释
你是不是一直在用厂家推荐的量做实验？你可能需要进行抗体滴定找到最佳抗体用量。
详见：
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2484-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-42-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1755-1-1.html

3、仪器--滤光片设置


确保流式机器配置有合适的、能够检测到你所用荧光的激光和滤光片。例如Brilliant Violet™ 570需要紫光激光器和585/42的滤光片，如果你用了525/50滤光片，那么就检测不到信号了。
不同荧光有不同的发射谱，为了检测到信号，需要配置有能够捕捉到该波长信号的滤光片。在上面的例子中，525/50滤光片只能捕捉500~550nm的信号，而BV570的峰值波长在570nm，超出了范围，故无法被该滤光片检测到。
还有需要了解每根激光有多少个光电倍增管（PMT），如果紫光激光器只有3个PMT，那么你想检测4色就不可能了。

4、仪器--激光性能


如果流式细胞仪的激光没有很好的校准，那么就可能导致某些通道（或所有通道）信号弱。使用一些校准微球可以很方便地检查仪器性能。所以记得按照流式细胞仪厂家的指导定期进行质量控制和优化检查。


5、抗原表达--表达密度


某些抗原本身就表达非常弱，或者只有非常少的细胞群体表达，此时，表达弱就是正常的。可以尝试选择强的荧光素或选择SI值高的抗体（参见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4167-1-1.html）

6、抗原表达--细胞特异性


有些单倍型特异性标记只表达在某些系别的小鼠上，所以购买抗体前需要详细阅读抗体说明。例如小鼠H-2K、I-A、CD90和CD45。
而且，流式细胞术基于逐级设门，如果门一开始设错了，也可能影响最后的分析结果，导致假性弱表达。

7、抗原表达--表达位置


要知道，有些抗原表达在细胞表面、有些表达在胞浆、细胞器内、胞核，甚至有些所有部位都表达。所以需要采用合适的方法学去检测。

8、抗原表达--诱导

诱导

有些抗原在活化后发生下调，而有些标记和细胞因子则需要诱导才能表达（参见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-716-1-1.html），如果你不经过诱导就检测这些标记或细胞因子，就会出问题。

9、缓冲液
你实验使用的缓冲液是否正确？例如Biolegend的FoxP3在他们自家的foxP3缓冲液中性能良好，但如果换了其它家的缓冲液，可能就检测不出来了。同样，其它厂家大多也是如此。固定和破膜缓冲液也十分重要。

10、二抗


如果你一抗用了纯化或生物素标记的抗体，那么二抗是否用了正确的抗体？例如一抗用了Rat Anti-mouse，那么你的二抗应该用Goat Anti-Rat，同时应该用只加二抗的管子作为空白对照检测背景荧光。
还有，你应该检测一下二抗是否还会跟其它一抗发生反应，这有助于发现是一抗还是二抗的问题。


11、固定
你是否在染色前固定或破膜了？固定和破膜能够改变抗原表位和抗体的相互作用，这种敏感性是抗原依赖性和克隆依赖性的。例如HIT2 (human CD38), 5C3 (human CD40), BC96 (human CD25)这几个表位通常在去污剂或甲醇处理后是不稳定的。而有些抗原位点则需要固定后才能与抗体结合而被检测到，例如核内抗原PCNA和Ki67。
此外，固定时间不能太长，否则容易导致交联反应而影响荧光素的化学特性或增加自发荧光。


12、贴壁细胞和受体

贴壁细胞

如果你在检测贴壁细胞，使用的是胰酶消化，那么需要注意胰酶可能会影响一些表面标记的表达。类似的现象也会发生在胶原酶消化后。

13、噪音和背景信号
PMT的背景信号和噪音高也会导致信号弱，这可能是由于激光源的散射光、其它荧光素的渗漏或自发荧光过强等原因引起。

14、荧光渗漏

补偿

荧光渗漏是多色流式时检测信号出问题最常见的问题所在。所以，正确的补偿非常重要。
关于补偿，请参见帖子：
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3523-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2191-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-20-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-396-1-1.html

wfz

图文并茂，流式细胞非常有发展前景

zj8237277

倪老师，您好！
第4点的3张图形没看懂，能否再帮解释说明一下。 谢谢！

niwanmao

zj8237277 发表于 2017-8-8 09:38
倪老师，您好！
第4点的3张图形没看懂，能否再帮解释说明一下。 谢谢！

就是商品化荧光校准微球测定各通道的线性相关度，可以反映机器的状态。

zj8237277

倪老师，能否帮再解释详细一些呢？    这3幅图是正常的嘛？  为何是这个样子的呢？    如是不正常的，那应该是怎么样的呢？谢谢！

zj8237277

还请有懂的大师，帮解答下。谢谢！

niwanmao

zj8237277 发表于 2017-8-10 10:54
倪老师，能否帮再解释详细一些呢？    这3幅图是正常的嘛？  为何是这个样子的呢？    如是不正常的，那应 ...

第一张看从弱到强每个荧光强度微球的CV值。
第二、三张是看两个通道之间的荧光线性相关性，因为这些微球的荧光都是定制的，所以跑出来应该呈线性相关，如果没有线性相关，说明其它某个通道出问题。

所以说，这三张反映的都是好的机器状态。

zj8237277

好的，多谢倪老师！