临床9色和10色流式细胞术（三）：仪器

niwanmao

流式中文网编译自Brent Wood. 9-Color and 10-Color Flow Cytometry in the Clinical Laboratory.Arch Pathol Lab Med—Vol 130, May 2006

多色流式细胞术的高效能力是由于结合了复杂光学收集装置和大量不同激发波长、发射波长的荧光素的结果。如第二篇连载所述，白血病和淋巴瘤分析需要能够检测9到10色的桌面型流式细胞仪，这种配置的机型现在来说有很多家公司都已经有了（包括BD、Beckman Coulter、ACEA等），但在2006年Brent Wood写这篇文章的时候，他的实验室还只有两台从BD LSRII改造过来的仪器，配置了407、488、594、634nm的激光，最多可测到11色，并且需要进行优化。

理念
通常，Brent对于仪器设置的理念就是确保仪器能够获得最好的性能（每种荧光均能获得最大的信噪比），并且为了获得最优性能，每日进行质控。如果质控做得好，就不需要随意更改条件，因为那可能会导致仪器性能降低。如果有可能，最好能够再做一项标准化和可重复的实验来检测仪器每日的性能。

滤光片
多数临床流式细胞仪的滤光片很少变动，不过，如果你准备使用一个少见的荧光素，可能就需要考虑改变滤光片了。一般说来，光学滤光片的作用就是尽可能排除无关的波长、使其它荧光素发出的光最小化、使目的荧光素收集的光最大化，第一个目的是为了减少背景，而其它两个目的由于荧光素发射谱的重叠则需要调节。如果滤光片增加太多，就容易导致补偿增大和灵敏度的丧失。然而补偿调节之后的分布还是影响很小的，所以问题不是很大。因此，最好选择波长范围稍微宽一点的滤光片，以收集到更多的光子信号，而不是为了最小化补偿而选择窄波长谱的滤光片，那样反而损害了荧光强度。

检测器电压
优化荧光检测（例如获得最佳信噪比）的关键一步就是正确设置光电倍增管的电压，使其既能把阴性细胞群和噪音水平分开，又能获得足够好的灵敏度和信噪比。
电压设置是否合理，可以用多峰的荧光微球检测（见图1）。

图1

图1、PMT电压的优化。8种荧光微球混合后，用不同PMT电压检测，每种阳性微球和最弱微球之间的Log mean值相除，得到的商，绘制成上图所示的曲线，可看出该值随电压的变化。上图可见，PE-cy7的平台期电压远远高于FITC，而其中能够获得最佳信噪比的电压，就是最优PMT电压。左侧FITC最亮的两条曲线最后向下交叉，这是由于它们的信号跑到坐标轴外面去了，导致计算不准确，亦提示了电压过大。



当PMT电压增高时，阴性细胞群的荧光也会逐渐超过噪音阈值，并且信噪比也会逐渐达到平台期，再增加电压不会提高信噪比。另一种方式就是叠加各个电压水平下的单参数直方图（见图2），通过不断提高电压使阴性峰和第一个阳性峰之间的距离增大，直至平台期出现。每个PMT的最佳电压就在平台期内区域。

图2

图2、PMT电压对微弱信号的影响。图1所示的FITC染色数据显示在直方图上，最强荧光的峰对齐之后，查看最弱表达的荧光峰与第一个阳性峰之间的距离变化，可以看到随着电压增大，其距离逐渐增大，直到平台期出现（绿色曲线400V、蓝色450V、红色500V、紫色550V）。



样本获取速率
每个仪器都有获取速率的限制，超过这个速率就会导致一些误差，例如数据丢失（又称dead time）。在一些数字型流式细胞仪上，dead time可通过调节时间窗口来控制，在LSRII平台上被称为window extension。这个数值越小，越能提高样本获取速率，并减少数据丢失。


面积vs高度
大多数现代型流式细胞仪可以获取事件脉冲时能同时获取面积、宽度、高度等参数，那么有人就提出问题了，我平时应该用哪个指标参数呢？
虽然面积参数理论上能够提供更精确的信号，但是在低强度的信号时，其基线鉴别和稳定性存在一定缺陷，而且，在激光延迟时间的变化会导致液流不稳定，进一步产生面积计算的误差。
对于造血细胞，其脉冲面积和高度之间存在线性关系，因为液流稳定性或基线很少影响脉冲高度，所以利用高度参数结合中等数值的event-processing window能提高仪器性能的稳定性、敏感性、处理速度。


粘连体
颗粒或细胞通过流式细胞仪时，激光有可能同时激发1个以上的颗粒，就叫做粘连体。粘连体的发生概率和颗粒通过速度有关，也就是说，与液流束的直径、颗粒的浓度。此外，样本处理、试剂等因素也会导致粘连体出现。
粘连体会对数据结果的分析造成很大的影响。通过结合面积、高度和宽度参数，能够排除掉粘连体的影响（见图3）。

图3

图3、粘连体排除。
急性髓细胞白血病的外周血用10个抗体标记后，以标准的氯化铵裂解液裂解后，在FSC 高度vs 面积的散点图上，可看到呈线性相关的一群单个细胞，同时还可看到一群粘连体（箭头所指处）。可以通过设门轻松排除，以利于后续数据准确分析。


补偿
仪器补偿的正确设置对于多色流式细胞术实验的成功非常关键。实时或离线补偿是目前在多色流式中可选的两种补偿调节方式。需要用每种荧光素对应的最强信号依次单染，逐管上机，进行补偿调节。但是，需要避免用那些超出坐标轴范围的过强信号来调节，因为这些超出坐标轴的信号是不正确的。如果用串联染料，即使同一种染料，在不同组合中也都要分开来调节，因为不同批号、不同厂家、不同时间的串联染料的发射特性可能都不一样（例如你在方案中用了三个PE-Texas Red抗体，那么这三个抗体都要进行补偿调节）。这就是软件补偿以外的tube-specific补偿。