临床9色和10色流式细胞术（四）：试剂

niwanmao

流式中文网编译自Brent Wood. 9-Color and 10-Color Flow Cytometry in the Clinical Laboratory.Arch Pathol Lab Med—Vol 130, May 2006

多色免疫表型大多数荧光素结合抗体都需要进行逐个评估，以验证其性能和稳定性，以确保组合在一起时，调节完补偿仍有足够的信号强度。

相对荧光素强度
构建抗体组合首先需要知道每个荧光素的相对强度，那些适合临床使用的代表性荧光素列在图4中。

图4

图4. 荧光素的相对荧光强度。图中各条曲线代表的是不同荧光素标记的CD4染外周血后的结果，分析的是淋巴细胞，阴性细胞群的右边界对齐，可以明显看到不同荧光素信噪比的区别。绿色代表FITC；深蓝色代表PE；淡蓝代表PE–Texas Red；品红色代表PerCP-Cy5.5；桔色代表PE-Cy7；红色代表Pacific Blue；黄绿色代表Alexa 594；淡绿色代表APC；蓝色代表Alexa 700；紫色代表APC-Cy7。


一般来说，PE和PE串联染料PE–Texas Red、PE–cyanine 5 (PE-Cy5)、PE-Cy5.5和PE-Cy7亮度最高，其次是APC和APC串联染料APC–Alexa 700和APC-Cy7，其它的小分子染料FITC、PerCP、Pacific Blue和Alexa系列染料，大约要弱一个数量级。细胞自发荧光可发生了可见光波长内，低波长段更多见，所以对Pacific Blue和FITC的分析会造成较大影响。



非特异性结合
每种抗体和荧光素均会存在一定程度的非特异性结合，就是结合到非相关表位。这种背景染色与抗体的克隆号等组成有关，故每种抗体使用前均需进行评估。
有些荧光素更容易结合到受损细胞或死细胞、碎片上，产生明显的背景染料，这种情况在花青素染料Cy5、Cy5.5、Cy7、Texas Red特别明显，但Pacific Blue、FITC、PE、Alexa 594和APC要好很多。
非特异性结合的表现形式就是在2个或更多荧光通道的散点图上，呈现对角线分布，故可在分析中排除掉。受损细胞和碎片可通过去除FSC小的信号做到很好的排除。而抗体的非特异性结合大多可通过预先与无标记的同种血清或免疫球蛋白孵育实现最小化，不过这种方法可能会造成后续的抗体结合问题，所以需要谨慎使用。


串联染料的稳定性
串联染料是指一个荧光素分子后连着一个或多个小的荧光素分子，形成串联状。这类荧光素发射光通常都是第二个荧光素分子发出的，第一个荧光素分子发出的很少。在特定条件下，第一个和第二荧光素分子之间的连结效率会降低，从而会使第一个荧光素分子的发射光增加。这样，就会造成补偿无法正确调节。
例如APC-Cy7在经常暴露于光照、固定时间过长、温度升高等情况下就很容易发生降解，降解后就会造成如图5所示的情况。

图5

图5. 串联染料降解。用CD45 APC-Cy7标记外周血，采用下述两种方法：（1）抗体加入到全血中，然后用含0.25％甲醛的氯化铵裂解液裂解红细胞（左图）；（2）全血先用含0.25％甲醛的氯化铵裂解液裂解红细胞，然后洗涤、静置1小时，再进行抗体染色（右图）。第一种全血染色法调节补偿后可看到正常的APC表达水平（阴性），而第二种先裂解的方法则看到APC通道的荧光呈现较明显地增高，并且补偿无法调节，提示染料发生降解。

所以，试剂的保存条件和标本处理均需要注意。


空间位阻
多个抗体加到同一管中，就存在1种抗体影响其它一种或多种抗体结合的可能性，尤其是这些抗体都针对一个大分子的时候。要排除这种相互作用，就需要进行抗体性能验证，比较简单的方法就是用一系列单染管与多色管进行荧光比较，如果多色管发生比较明显的荧光降低，就说明存在空间位阻可能。
不过，按照我的经验，这种情况发生可能性很小。


抗体相互作用
抗体之间除了可能发生空间位阻外，还可能有其它相互作用影响其性能。这种相互作用有可能形成荧光强度的相互增强，造成补偿不正确的假象。要排除这种作用对结果的影响，可采用更换克隆或逐一去掉其中一个抗体的方法验证（即FMO对照），FMO对照还适合用于调节补偿，如图6。

图6

图6. 抗体相互作用的演示。用CD38 Alexa 594和CD13 PE-Cy7染骨髓细胞，CD13的克隆号不同。可看到左图的CD13阳性，更换克隆号之后，右图中的CD13就是阴性的，提示左图是假阳性。

我在平时观察到很少量的由于抗体克隆或荧光素引起的抗体相互作用，通常是由于血浆中补体分子造成的，所以只在少量样本中会出现。了解组合中每个抗体的特性，有助于在平时发现和避免这种情况。