临床9色和10色流式细胞术（五）：抗体方案的构建

niwanmao

流式中文网编译自Brent Wood. 9-Color and 10-Color Flow Cytometry in the Clinical Laboratory.Arch Pathol Lab Med—Vol 130, May 2006

选择抗体及其荧光素是确保信号强度和检测灵敏度的关键性因素，大多数情况下，也是决定实验成败的关键步骤。您可以通过以下4步构建抗体方案：
一、明确每个抗体组合想要实验的目的
每个抗体组合都应该着力于阐明一个或多个目标问题，如果该组合是大方案的组成部分之一，那么这个方案对于目的细胞群的区分能力就更加需要考虑了。

二、选择一组细胞标记
一组理想的细胞标记应该通过不同的试剂组合搭配进行验证，其目的就是看这一组标记是否能解决我们的问题。在这一步选择标记时，暂时不需要去考虑荧光素搭配，而是要看是否有商品化试剂。针对同一个大分子复合物的不同抗体应该避免同时使用，除非已经证明他们之间不会冲突。
选择标记时，应考虑最小化，就是说能够解决问题所能使用的最少抗体。使用一些不必要的抗体不仅增加费用消耗，而且可能会影响整个方案的效能。

三、给每个细胞标记分配荧光素
基本原则是高表达抗原分配弱的荧光素，低表达的抗原分配强的荧光素。（流式中文网注：现在荧光素选择多了，其实还需要注意结合荧光素后抗体的信噪比）。
荧光素选择的第二个关键点就是需要注意发射光谱之间的重叠问题，这会影响到灵敏度和背景噪音，这在发射光谱重叠大的荧光素搭配中特别明显（见图7）。

图7

图7 荧光素发射光谱重叠对灵敏度的影响。淋巴细胞用CD8 PE标记后，可见到发射光向PE-Texas Red通道渗漏明显（A），高表达的CD8+细胞群和弱表达的信号同时分布在对角线上，无法区分（A图箭头所指处）。当补偿正确调节后，就可看到CD8高表达的阳性细胞群（B）。不过在调节补偿后的B图，我们同时也可以看到不同表达强度CD8细胞，其PE-Texas Red通道受影响的程度不同，这就提示如果PE荧光过高，会影响PE-Texas Red的检测灵敏度。


因此，当与其它强荧光素抗体搭配检测弱荧光素信号时，灵敏度就会受到明显影响。所以荧光素分配时我们还需要采取以下几种策略：
1、把表达在不同细胞群、不同成熟阶段、不同功能亚群上的抗体搭配在一起。
2、避免使用过高荧光强度的荧光素，否则容易影响弱表达抗原的检测。
3、尽量把那些可能双阳性或双阴性表达的抗体放在一起。

在搭配荧光素时，有些人可能会考虑这种荧光素试剂是否有商业化产品，其实随着荧光素定制服务的发展，这种顾虑其实可以暂时搁下。


四、测试试剂组合
确定好抗体和荧光素之后，接下来就是确保组合在实际应用中是否能够检测到低水平表达，并确保抗体之间不会产生意外的相互作用。前面已经讲过，用抗体组合标记后，应该与FMO对照、单标管进行逐一对比，以确保该组合正常工作。如果试剂之间发生明显的相互作用，那么就会在二维散点图上看到与单标管不同的异常分布。

五、把试剂混合起来
通过以上4步，确定好了合适的抗体组合，那么在实际使用过程中，可以预先把抗体混合在一起，然后在分到各管中，既可以减少加样误差，又可以使标本制备标准化、一致化。不过在混合之前，需要对每个抗体进行滴定，以确定其最佳用量。