免疫相关性血细胞减少症及其流式检测

niwanmao

免疫相关性血细胞减少症(immuno-relatedhemocytopenia，IRH)是近十余年从骨髓衰竭性疾病中分离出的一类新的疾病体系。其发病机制是由于某种未知病原刺激后，主要抗原呈递细胞树突状细胞亚群出现异常，引起下游T淋巴细胞调控失衡，导致B淋巴细胞数量、亚群、功能异常，进而产生仅针对骨髓造血细胞的自身抗体，通过介导巨噬细胞吞噬、激活补体原位溶血或封闭造血细胞膜上的功能蛋白，抑制造血细胞增殖分化而导致骨髓衰竭或无效造血。


IRH的诊断主要依据患者临床表现和实验室检查结果综合诊断。其拟诊标准为：
①两系或全血细胞减少，网织红细胞和(或)中性粒细胞比例不低；骨髓中红系细胞比例正常或偏高，易见红系细胞“造血岛”及红细胞吞噬现象；
②除外其他原发、继发血细胞减少症。

其确诊标准为符合拟诊标准，并进一步应用BMMNC-Coombs试验(凝集法)或FCM检测到骨髓造血细胞膜自身抗体(荧光法)即可确诊(治疗前确诊)；若未进行检测或未检测到骨髓未成熟造血细胞膜结合自身抗体，但经HDIVIG和(或)糖皮质激素等免疫抑制剂治疗有效也可确诊(治疗后确诊)。


BMMNC-Coombs试验阳性率约为67％，其灵敏性为60.3％，特异性为100％；FCM检测自身抗体阳性率约为90％，其中干祖细胞自身抗体阳性率约94.1％，有核红细胞自身抗体阳性率约43.1％，粒细胞自身抗体阳性率约为66.7％。
上述2种实验仍存在一定缺陷：BMMNC—Coombs试验灵敏性偏低，FCM检测法易出现假阳性(尤其是在CD34+干祖细胞上)，仍有少部分患者临床特征极似IRH，但2种方法均未检测出自身抗体等。

对FCM检测方法进行了改进：
①提取肝素抗凝的新鲜骨髓后应先用PBS洗涤3次，去除细胞表面非特异性吸附的免疫球蛋白等可能干扰检测的物质，减少假阳性率，提高特异性。
②以往数据显示干祖细胞自身抗体阳性率偏高，经过长期的临床观察，我们发现此部分实验特异性明显低于其他细胞系。究其原因主要是由于CD34干祖细胞数量极少，以往检测过程中只在前向角(FSC)和侧向角(SSC)的散点图中利用单一设门选取骨髓单个核细胞团的方法易出现假阳性。因此，我们选取骨髓单个核细胞后再次应用CD34和SSC设门，纯化这部分细胞，之后再检测其细胞膜上自身抗体的阳性率。同时，建议上机检测时至少收集lO万细胞，确保足够数量的CD34。。干祖细胞，可明显降低假阳性。
③在每次检测前，注意利用单阳管(CD15+、GlyCoA+、CD34+)调整FITC和PE两种荧光素之问的补偿，以保证实验的准确性。
④建议取材时注意骨髓的增生程度，如部分患者髂骨增生重度减低，实验过程中无法得到足够数量的造血细胞，可能出现假阴性或假阳性，导致实验误差。这种情况下可考虑抽取胸骨骨髓标本，有利于提高实验准确率。

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2015-3-24 15:09 上传

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＝＝＝＝检测方法＝＝＝＝
邵宗鸿教授等人在Clinical and Developmental Immunology Volume 2013上发表了《Detection and Analysis of Autoantigens Targeted by Autoantibodies in Immunorelated Pancytopenia》，那篇论文中较为详细的描述了BMMNC-Coombs试验和流式检测自身抗体的实验步骤，现翻译如下：

BMMNC-Coombs试验
新鲜肝素抗凝的骨髓标本（5ml）用PBS以1：1稀释，加至 淋巴细胞分离液上，低速离心20分钟（流式中文网注：似乎没有讲多少转速）。离心后抽取单个核细胞白膜层，然后再用PBS洗涤三次。最后用PBS重悬细胞，浓度4~5×10E6/ml。
抗人血清 (IgG, IgA, IgM, and C3)稀释成工作液，工作液与细胞悬液以1：1混合，然后在37℃孵育30分钟。最后，显微镜下观察凝集情况。

检测结果：
左侧阴性，右侧阳性

流式检测自身抗体实验步骤
新鲜肝素抗凝骨髓标本（400μL）用PBS洗涤三次，然后分至4管：
第1管（同型对照）－小鼠IgG1-FITC、小鼠IgG1-PE、小鼠IgG1-APC
第2管－CD15-FITC
第3管－ GlyCoA-FIT
第4管－CD34-FITC
然后再往这4管中加入Anti-human IgG-PE和anti-human IgM-APC (BD PharMingen)
避光4℃孵育30分钟，然后与2ml红细胞裂解液室温作用10分钟，PBS洗涤三次。最后上机获取，至少获取3万~10万个细胞。

粒细胞、有核红细胞、干细胞均可见自身抗体表达


全文链接：http://www.hindawi.com/journals/jir/2013/297678/

wfz

方法很好，值得推广

aninawang

学习了，感谢！