请教流式抗体滴定与染色异常问题

cubica

各位老师好！
我购买了几个BD的流式抗体来做血液淋巴细胞的染色，首先就做了一个抗体滴定，遇到了几个问题，谢谢帮忙看看是什么情况
第一个问题，如图所示，我做了CD4抗体的滴定，怎么看哪一个浓度最合适？

CD4滴定

第二个问题，我在染CD8的时候，发现染出来两群细胞，

CD8滴定

于是我对两群细胞圈门发现两群细胞均有可能是淋巴细胞，这是怎么回事呢？

CD8两群分析

第三个问题，我在做CD3染色的时候发现，染出来的细胞没有特异性，我分析了一下，发现大部分细胞都被染色染上了。

还有最后一个问题，我自己标记了一个CD25抗体，染色时发现大部分淋巴细胞和粒细胞都被染上了颜色，且比CD4染上的细胞多多了，显是不对的，跟上面这个CD3染色还有几分像。说不特异，单核细胞好像又没有染上，那究竟是怎么回事呢？

我是一个流式新手，一开始就遇到这么多问题，请老师帮忙看看我的这些问题出在哪里，谢谢！

niwanmao

一开始做流式就做滴定，这是非常好的习惯，需要大力表扬。

1、计算信噪比，就是阳性峰的median除以阴性峰的median。计算染色指数，则是阳性峰和阴性峰的median之差，除以阴性峰基底宽，两者都可以确定抗体滴定最佳浓度。肉眼看似乎是0.63ug/ml或1.25ug/ml。

2、CD8弱阳性的那群是正常的NK细胞或Tc细胞。一般正常人应该不是很多的，你这个标本是什么病人？

3、建议加一个PI染料或7-AAD等鉴别细胞死活，上机前1分钟加入，不排除这种非特异性染色是由于死细胞引起。

4、同3

tjj4763

倪老师好厉害。

jiangmeng

niwanmao 发表于 2015-3-25 12:00
一开始做流式就做滴定，这是非常好的习惯，需要大力表扬。

1、计算信噪比，就是阳性峰的median除以阴性峰 ...

老师，如果该细胞的某抗原的表达本来就很低，这个时候需不需要进行滴定，或者这种情况该如何选择合适的抗体浓度；还有如果使用说明书推荐抗体用量，阴性和阳性群分得很开，这时候可以不做滴定吗？

niwanmao

jiangmeng 发表于 2016-12-1 18:57
老师，如果该细胞的某抗原的表达本来就很低，这个时候需不需要进行滴定，或者这种情况该如何选择合适的抗 ...

抗原表达本身就低，也是可以滴定的，可以找一种表达该抗原比较强的细胞进行滴定，因为你要找的是合适的抗体使用浓度，跟细胞无关。

如果使用推荐量，阴性和阳性分得开，并不意味着是最佳，如果有可能最好滴定。

jiangmeng

niwanmao 发表于 2016-12-1 19:30
抗原表达本身就低，也是可以滴定的，可以找一种表达该抗原比较强的细胞进行滴定，因为你要找的是合适的抗 ...

但是好像在您一个帖子里面说，每种细胞可能有不同的最佳滴度。
打个比方，我做小鼠骨髓细胞和外周血细胞的检测，我发现CD34这个抗原表达很低，而且分群不明显，我是应该用骨髓细胞和外周血细胞分别滴定吗？
还是可以用其他表达强的细胞来代替滴定？

niwanmao

jiangmeng 发表于 2016-12-2 05:49
但是好像在您一个帖子里面说，每种细胞可能有不同的最佳滴度。
打个比方，我做小鼠骨髓细胞和外周血细胞 ...

用高表达CD34的细胞，例如某些白血病细胞滴定。

minazeng

niwanmao 发表于 2015-3-25 12:00
一开始做流式就做滴定，这是非常好的习惯，需要大力表扬。

1、计算信噪比，就是阳性峰的median除以阴性峰 ...

倪老师，您好！ 我想请教一下，多色染色也必须滴定吗？因为我现在做的是4-5色的，如果每个颜色都滴定的话，组合非常的多，试剂和标本都有点耗不起。请问这种情况有什么好的方法吗？谢谢

niwanmao

minazeng 发表于 2017-9-24 23:24
倪老师，您好！ 我想请教一下，多色染色也必须滴定吗？因为我现在做的是4-5色的，如果每个颜色都滴定的话 ...

可以先按照常规用量做一遍，对表达效果欠佳的，再进行滴定。这样节省滴定工作量。

minazeng

niwanmao 发表于 2017-9-25 08:39
可以先按照常规用量做一遍，对表达效果欠佳的，再进行滴定。这样节省滴定工作量。 ...

哦哦，原来如此，就是我现在已经做出来了，那请问老师表达效果好不好的具体标准有么？比如像您在前面提及到的信噪比和染色指数一般达到多少可以认定为表达效果好呢？ 谢谢您！