淋巴细胞亚群分析的圈门问题

曼爱生物

从去年开始到现在，做了几次（荷瘤及未荷瘤）小鼠脾脏、肺脏以及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），目的是想分析不同的免疫细胞亚群的比例以及部分细胞上的marker，但是每次做收完细胞看着都不一样，不知道到底该圈那些细胞去分析了。分析TIL时，最开始是打算用ficol或者percoll分出来在上机的，但是老师说分的效果太差了让直接上机用CD45把淋巴细胞圈出来，可是做了一次也是根本不知道该怎么圈门了，FSC-SSC的图跟倪老师之前上传的淋巴细胞分群的图也不一样，而且用不同的红细胞裂解液处理的细胞流式出来的图也不一样，师姐说只见过BD的红细胞裂解液处理的细胞能做出来粒单淋明显的三团细胞，现在把我做的几次的图片传上来，希望能有人给我指导一下，看圈的对不对，应该怎么圈，哪种红细胞裂解液比较好，尤其是TIL那张图该怎么处理，谢谢了！

索莱宝红细胞裂解液处理的小鼠脾脏细胞

肿瘤浸润淋巴细胞TIL，收完根本不知道该怎么分析，那一团才是想要的细胞

自己配的红细胞裂解液处理后

肺脏研磨后分析

niwanmao

个人觉得你这三张设了门的图片应该还是设的对的，未设门的这张分群不清，还是跟细胞活力差有关，建议可以加入CD45和live/dead试剂解决。

裂解液一般用自己配的氯化铵裂解液即可，配方可搜索站内：）

爱白衣杀手

我也做了类似的，也是新手，也在相同的问题困惑了一段时间，按楼上倪老师所说可清晰画出淋巴细胞。祝好运。不用密度分离就可以。

曼爱生物

niwanmao 发表于 2015-4-6 19:46
个人觉得你这三张设了门的图片应该还是设的对的，未设门的这张分群不清，还是跟细胞活力差有关，建议可以加 ...

没有设门的那张是肿瘤组织的细胞，其他的是脾脏后者肺脏，我还想问那几张圈门圈的明显是两团细胞，这有影响吗，如果还想看粒细胞应该圈那一部分呢？

小憨

其实有专门的TILs分离液的，国产的，很便宜，也可以考虑使用，分离步骤也简单。
关于裂解液我推荐倪老师说的氯化铵类的裂解液，配方简单：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-178-1-1.html
一个小鼠脾脏细胞悬液加1 mL，冰上2 min效果杠杠滴~
如果裂解时间过长（我试过10 min），就会出现你的第三张图那样的结果，在FSC/SSC上细胞明显分两团。
以上仅是个人经验，希望能帮到你。