什么是自发荧光？

niwanmao

在流式检测时，你可能经常发现你标记的抗原信号被自发荧光干扰，造成假阳性，这个问题给你的实验带来了极大的困扰。

那么自发荧光是如何引起的呢？既然叫自发，那肯定就是细胞本身因素引起的，最常见的原因就是细胞内的成份（例NAD(P)H、胶原纤维、核黄素等），还有芳香族氨基酸（例如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等）。
这些成份通常激发光波长在紫外光到蓝光范围（355～488nm），发射波长在蓝光到绿光范围（350～550nm），因此常常会导致FITC、Pacific Blue等荧光素检测的灵敏度，降低了信号分辨能力。

自发荧光

自发荧光往往会随着细胞增大而增加，因为大细胞包含的上述自发荧光物质比小细胞要多。

那么如何解决呢？
也很简单，就是避免使用前述FITC、PB等通道荧光素，改用PE、PerCP-cy5.5、PE-cy5.5、PE-cy7等，甚至采用红光激发的荧光素APC等。

家的感觉

有的实验必须要使用FITC荧光染料的话，那么自发荧光就不可避免是吧

niwanmao

家的感觉 发表于 2015-6-3 09:41
有的实验必须要使用FITC荧光染料的话，那么自发荧光就不可避免是吧

什么实验必须用FITC染料？

家的感觉

niwanmao 发表于 2015-6-3 10:09
什么实验必须用FITC染料？

有的老师说他的实验需要用，具体不清楚啥实验

niwanmao

家的感觉 发表于 2015-6-3 10:14
有的老师说他的实验需要用，具体不清楚啥实验

任何事情都有解决方法，现在荧光素可选择的这么多，为什么非FITC不用。

zhang4083

那我们做白血病的时候，几乎都用到FITC如何解决这个？
为什么FITC通道自发荧光强？
为什么PE通道自发荧光弱？
明白了：发射波长在蓝光到绿光范围（350～550nm）


但是第一个问题还是如何解决？（那我们做白血病的时候，几乎都用到FITC如何解决这个？）

niwanmao

zhang4083 发表于 2015-6-3 13:25
那我们做白血病的时候，几乎都用到FITC如何解决这个？
为什么FITC通道自发荧光强？
为什么PE通道自发荧光弱 ...

平时我们做临床标本的时候，其实自发荧光都不强的。自发荧光最强最常见的标本是科研标本，培养过的细胞。所以你无需过分担心：）

wzr19990923

那375nm和405nm激发的荧光素都不适合吧？

zhang4083

wzr19990923 发表于 2015-6-3 21:08
那375nm和405nm激发的荧光素都不适合吧？

如果倪老师下面所言是正确的，那么你说的激发光就不合适：
还有芳香族氨基酸（例如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等）。
这些成份通常激发光波长在紫外光到蓝光范围（355～488nm）


但是，最我认为还是接受光比较重要，因为接受的数据才是我们关心的。所以最好不要用FITC波段附件的荧光素抗体

niwanmao

wzr19990923 发表于 2015-6-3 21:08
那375nm和405nm激发的荧光素都不适合吧？

凡事都有度，只要自发荧光不强，并且抗原表达阳性、阴性分的好，任何荧光素都可以用；但如果自发荧光很强，并且抗原表达阳性强度不高，那么需要避免PB和FITC等通道的。