同型对照，何时用？何时不用？

niwanmao

抗体的Fab段可能会与细胞表面发生低亲和力、非特异性结合，尤其是细胞死亡时，胞膜受损，这种非特异性结合会更加明显。所以，平时实验中大家经常会用同型对照来确定背景荧光水平。同型对照曾经是流式实验中经典的阴性参照，但实际上同型对照的选择很难，因为要达到同型对照与抗体的交叉反应能力完全一样，就要求物种、亚型、荧光素、荧光素：蛋白质比例、浓度等各方面完全一致，暂且不提自己能够挑选正确，就连厂家都不一定每次能够做到完全一致。

所以，我们总结一下同型对照的适用情况，归纳一下哪些情况下不需要同型对照，以及使用同型对照的注意事项：
1、如果抗原表达为双峰分布（即阴性峰和阳性峰明显分开），那么就不需要同型对照。例如外周血T细胞的CD4、CD8的表达（如下图）。



2、如果你检测的是培养后的细胞，那么同型对照可以给你一些反映细胞粘附能力的信息，但无法反映其它非特异性荧光（详见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4181-1-1.html）

3、如果你的实验中同时用到多种荧光素，分析时荧光渗漏对结果影响较明显，而背景荧光不明显，那么最好用FMO（荧光扣除对照，指的是除掉检测通道的荧光素，其它荧光都加上，详见http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4153-1-1.html）。

4、同型对照是参考，但不能直接、单纯凭此确定阳性阴性分界点或以此设门，因为同型对照只能反映非特异性结合的背景荧光，而背景荧光如第2点的链接所述，还有其它因素引起的。

5、需要进行目标抗体的滴定，以降低非特异性结合的背景荧光。因为抗体量过多，会造成阴性峰的偏移和基底增宽，如下图。



6、如果你使用同型对照时发现非特异性结合水平很高，那么就要注意进行Fc阻断了，目前有商业化的Fc阻断剂，也可以用免疫球蛋白或血清阻断。

7、对于细胞信号转导和细胞因子检测，除了FMO对照，还需要设置生物学阴性对照，例如未刺激细胞或用磷酸化抑制剂处理的细胞。

8、记得在多色方案中加入细胞活性染料，以去除死细胞。死细胞的非特异性染色很强。

Justin-威

是我们初学者的指路明灯啊

靠运气吃饭不好

谢谢倪老师 很有启发