人PBMC测Treg设门问题

goddoor

购买的是Eb专门测人Treg的试剂盒，提PBMC后染色上流式，CD4-FITC，CD25-APC，FOXP3-PE，只做了FOXP3的同型，同型对照的抗体与实验抗体来自同一厂家，种属等都是相同的。原始数据在Flowjo上分析时遇到如下困惑，还请高手帮忙解答：
1、干预前Treg：在CD4+T淋巴细胞圈CD25+FOXP3+细胞，得到如下散点图，以十字门设门Treg比值为10.6%。若换成密度图再圈门比值增大，请问这种情况应该按哪种方法设门？

干预前密度图

干预前散点图

2、干预后测Treg：还是在CD4+T淋巴细胞圈CD25+FOXP3+细胞，先根据同型对照设门（左图），再将此门应用于实验组，但是整群细胞都往上移，像这种情况我应该把十字门再往上移点吗？

第三个问题：造成细胞整群上移的原因是什么，是因为背景荧光太强吗？可以采取什么措施避免这种情况？因为临床采血较困难，未做抗体滴定，按厂家的说明书做的，这种情况是否还必须做抗体滴定

FOXP3同型对照

据同型对照设门

niwanmao

对于这类分群清楚的细胞，就圈分群的这群即可，不要用十字门。

干预之后，可能是干预因素影响了细胞自发荧光水平，所以会导致PE上调，但是分群清楚，就直接圈分群的那群就行。

goddoor

niwanmao 发表于 2015-6-14 12:30
对于这类分群清楚的细胞，就圈分群的这群即可，不要用十字门。

干预之后，可能是干预因素影响了细胞自发荧 ...

谢谢倪老师解答。第二个问题我没表述清楚，第三个和第四个图都是干预后的同一个样本的细胞，表染后固定破膜，第三个做的FOXP3同型，第四个是正常染的FOXP3，按理说一样的细胞位置应该差不多，像这种整群上移我应该怎么设门？

niwanmao

goddoor 发表于 2015-6-14 15:45
谢谢倪老师解答。第二个问题我没表述清楚，第三个和第四个图都是干预后的同一个样本的细胞，表染后固定破 ...

分群清楚时，不根据同型设门，只根据实际分群。

goddoor

niwanmao 发表于 2015-6-14 21:41
分群清楚时，不根据同型设门，只根据实际分群。

学习了，谢谢倪老师