分享两个主要关于流式分选的技巧

Arcrain

1.为了提高细胞分选活性，有些人的做法是将染完色的细胞悬浮在培养细胞用的完全培养基当中，也可能会在接收细胞的管中预先加入完全培养基来防止细胞直接撞击在管壁上，同时为细胞提供更好的保存条件。但完全培养基（DMEM）的缓冲体系是在CO2培养箱中使用的，其中的NaHCO3需要CO₂来对应缓冲，这种缓冲体系的优点是无任何有害作用。但它如果暴露在空气中，因缺乏CO₂，会使培养基PH值很快上升，而细胞耐酸不耐碱，因此实际上会影响细胞活性。我们培养细胞时也应该注意减少在空气中暴露培养有细胞的完全培养基的时间。

培养基中的酚红显著增加某些通道（如FITC）的背景光水平。


更好的缓冲液是在无Ca2+、Mg2+的PBS中加10-25mM的HEPES，1mM的EDTA，1%的glucose，2%FBS，PH7.4。保护细胞的同时减少细胞粘连。HEPES缓冲体系适合于空气，缓冲能力很强，但浓度过高会对细胞有一定毒害作用。需要注意，这虽然是一个良好的配方，但需根据细胞和实验来调整。例如，比较皮实的细胞或者担心会影响荧光染色，一般不加FBS；葡萄糖浓度非常高，比高糖DMEM还高，对于干细胞是否合适就需要考虑了。


用来填充接收管的缓冲液也可以用这个，但一般会加点FBS。有的有钱人用纯的FBS来接收细胞，效果也很好。我觉得FBS渗透压不同于细胞通常的培养环境，会影响细胞形态等等，如果觉得2%FBS少，多加点就好了，还能节省点。


2.一条科学性的逻辑：任何测量过程的速度必须总是比测量对象的变化过程要快得多。在流式分析分选当中同样需要遵守，但通常易被忽略。如，目的细胞含量低，分选4-10个小的时间，提取细胞mRNA进行后继实验，这就是不合适。依据GFP表达水平分选干/祖细胞，GFP变化速度快，长时间分选当然也不合适。分选单个细胞出来进行反转录PCR或深度测序，当然更要求在尽可能短的时间内完成分选，且分选过程对细胞的影响尽可能的少。

椴树

学习了，以前都是直接用完全培养基重悬的。有一个问题如果分选出来的细胞量少的话，会发现很难把细胞离心下来，不知大家怎么解决？如果细胞阳性率低，最终收到的细胞量很少，而且阳性率低导致分选时间也会很长，5ml流式管收的话，避免细胞打到管壁干掉，不是得加多点收集液体么？3ml收集液体如果只能收到小于5w细胞的话，通常是很难离心下来的啊。

椴树

学习了，以前都是直接用完全培养基重悬的。有一个问题如果分选出来的细胞量少的话，会发现很难把细胞离心下来，不知大家怎么解决？如果细胞阳性率低，最终收到的细胞量很少，而且阳性率低导致分选时间也会很长，5ml流式管收的话，避免细胞打到管壁干掉，不是得加多点收集液体么？3ml收集液体如果只能收到小于5w细胞的话，通常是很难离心下来的啊。

niwanmao

椴树 发表于 2015-6-29 23:56
学习了，以前都是直接用完全培养基重悬的。有一个问题如果分选出来的细胞量少的话，会发现很难把细胞离心下 ...

看来实际操作中还是存在不少难题。流式分选技术需要完善。

lizhirong2002

椴树 发表于 2015-6-29 23:56
学习了，以前都是直接用完全培养基重悬的。有一个问题如果分选出来的细胞量少的话，会发现很难把细胞离心下 ...

收的细胞很少的话，我们一般是分管收集，比如说已经收了一管5ml的，就取出其中2ml放入下一管5ml继续收集，液体量不变，细胞数累积。但这样的话，分选的时间还是有点长。

椴树

lizhirong2002 发表于 2015-7-2 14:41
收的细胞很少的话，我们一般是分管收集，比如说已经收了一管5ml的，就取出其中2ml放入下一管5ml继续收集 ...

液体量不变？细胞数增加？没太懂，因为如果我最后只能收到3w细胞的话，这3w细胞加上鞘液在一起最后也只多出来不到500ul液体，我一管就能收完啊，不存在分管收集的问题啊。你说的分管应该是指阳性率低，但是细胞总数很多，所以最后也能收到不少细胞。不知道理解的对不对。这并不能解决阳性率低，目的细胞少的情况啊。

lizhirong2002

椴树 发表于 2015-7-3 13:28
液体量不变？细胞数增加？没太懂，因为如果我最后只能收到3w细胞的话，这3w细胞加上鞘液在一起最后也只多 ...

转收下一管之前稍微离下心，不知道这个方法对于你的细胞是否适用