转染后带GFP荧光的细胞还能再做流式测其它通道荧光吗？

潜才lxl

各位前辈你们好，我是新手，想请教一个问题，我转染了一个带GFP荧光的慢病毒进细胞，现在想检测它的表面分子，可以做其它的通道的荧光吗？会不会因为GFP荧光太强干扰其它通道做不出来？

niwanmao

可以测的。其它通道的荧光可以通过补偿把GFP影响排除掉。

潜才lxl

niwanmao 发表于 2015-7-3 09:07
可以测的。其它通道的荧光可以通过补偿把GFP影响排除掉。

哦哦，谢谢老师，那是要做同型对照吗？可以不做同型对照去掉GFP的影响吗？抗体实在是太贵了。。。。

小憨

可以的，但是需要调节补偿，GFP在一通道检测，会向PE通道漏少量，PE之后的通道就不会再有补偿了。

niwanmao

潜才lxl 发表于 2015-7-3 09:31
哦哦，谢谢老师，那是要做同型对照吗？可以不做同型对照去掉GFP的影响吗？抗体实在是太贵了。。。。 ...

你是说其它通道吗？其它通道得看非特异性染色水平高不高，如果不高也可以不用。

潜才lxl

niwanmao 发表于 2015-7-3 16:30
你是说其它通道吗？其它通道得看非特异性染色水平高不高，如果不高也可以不用。 ...

谢谢站长，我们这边做流式的有个老师说，要看我转染的GFP荧光的强度，要是很高的话也做不出来，另一个老师说做了补偿就可以做，所以不懂到底能不能做了，抗体很贵，买回来做不了就浪费了，不知道到底能做不？

潜才lxl

小憨 发表于 2015-7-3 14:40
可以的，但是需要调节补偿，GFP在一通道检测，会向PE通道漏少量，PE之后的通道就不会再有补偿了。 ...

谢谢，你们以前做过吗？是不是不管多强的GFP荧光都能做呢？

小憨

潜才lxl 发表于 2015-7-6 09:40
谢谢，你们以前做过吗？是不是不管多强的GFP荧光都能做呢？

嗯，我们做过的。
如果转染效率很高的话，GFP为强阳性，在直方图阴性峰和阳性峰会分的非常开，有可能会在一张图上显示不了，阴性峰出来阳性峰就被压到右边上了，阳性峰出来阴性峰就压到左边了，所以如果需要分析阳性细胞，就把电压调到阳性适合的地方再分析，所以建议你用C6这种“广角镜头”流式细胞仪分析。

燕仔zoe

潜才lxl 发表于 2015-7-6 09:40
谢谢，你们以前做过吗？是不是不管多强的GFP荧光都能做呢？

可以做的，补偿和阳性是分属两个不同概念，就算再强的GFP阳性，一般也是能做的，阴性压线没关系的，或者你可以点开负轴显示。

五味瓶JJJ

niwanmao 发表于 2015-7-3 09:07
可以测的。其它通道的荧光可以通过补偿把GFP影响排除掉。

老师您好，我想用流式检测细胞的转染率（携带GFP），实验需要怎么设计啊？