Th17染色问题

v2002lichao

最近两次做T细胞分型染色，Th17经常出现问题。上图：加完抗体之后连阴性峰都没有了。哪位老师能解释一下 这是什么的问题呢？我做了IL-17-PE和ISOtype。都出现了类似的问题。但是时好时坏。同一管抗体做的结果都不一样。有的正常，有的就这样了。

niwanmao

可能原因：
1、获取的流速问题，可调为低速试试；
2、电压问题。

如果都没问题还是如此，可以采用biexponentional transformation把压轴信号显示出来。

v2002lichao

niwanmao 发表于 2015-7-25 21:34
可能原因：
1、获取的流速问题，可调为低速试试；
2、电压问题。

电压我是用阴性管调的。肯定是没问题的。因为每次电压都是按照同样原则调的。只有最近总出问题。流速方面高中低都用过，还是有问题。倪老师 您不觉得是抗体的问题么？

v2002lichao

niwanmao 发表于 2015-7-25 21:34
可能原因：
1、获取的流速问题，可调为低速试试；
2、电压问题。

回复里为什么不能上传图片呢？

niwanmao

v2002lichao 发表于 2015-7-25 21:48
电压我是用阴性管调的。肯定是没问题的。因为每次电压都是按照同样原则调的。只有最近总出问题。流速方面 ...

不稳定肯定不是抗体的问题，首先排除掉自己染色问题，就可以确定是机器的问题，一般都是液流原因。

建议你用diva软件的biexponential transformation调出压轴的信号。

至于回复中上传图片，需要点击回复后弹出的窗口中，点“高级模式”。

v2002lichao

niwanmao 发表于 2015-7-26 19:46
不稳定肯定不是抗体的问题，首先排除掉自己染色问题，就可以确定是机器的问题，一般都是液流原因。

建议 ...

谢谢 倪老师的及时回答。我的实验因为这个事停了两天。看到您的回复赶紧跑回流式实验室重新用慢速上了一遍样品。结果发现确实需要用慢速才可以。但是这样上样真的很慢，每秒100多个细胞，收50000真是挺折磨的。不过没办法了。还是慢慢来吧。上一下您说的biexponential transformation的图片吧。希望后来人能借鉴。

bimawenlaile

这种情况可能是因为加抗体的时候，把沉淀的也吸上来了（颜色很深的，特别是PE染料），流式上表现为荧光很高，图形不能完全显示出来（上图中PE所示），  我也遇到过，特别用高速获取的时候更明显，建议用枪把抗体打匀，不要吸取颜色很深的沉淀。另外PMA刺激后CD4分群不明显哦。

v2002lichao

bimawenlaile 发表于 2015-7-27 17:27
这种情况可能是因为加抗体的时候，把沉淀的也吸上来了（颜色很深的，特别是PE染料），流式上表现为荧光很高 ...

谢谢您的回复，抗体沉淀的问题我也注意到了。现在都是用手摇晃，之后离心再抽取。上样我也都改用低速了。希望下次能有好结果。

v2002lichao

bimawenlaile 发表于 2015-7-27 17:27
这种情况可能是因为加抗体的时候，把沉淀的也吸上来了（颜色很深的，特别是PE染料），流式上表现为荧光很高 ...

我提的原代细胞，培养过夜后在再刺激染色CD4分群就比较理想了