小鼠定义B细胞群体百分比及绝对计数问题

十二郎

各位好，小硕是做转基因小鼠的，请教一个细胞绝对计数及群体百分比的问题，描述如下：
如图一所示：在描述骨髓中B细胞占骨髓中总细胞的百分比的时候，疑问如下：
1、文章以B220阳性定义为B细胞，通过流式检测B220阳性的百分比的时候，是直接冲出骨髓总细胞于PBS中，然后直接进行染色吗？？
2、既然是测定占总细胞的百分比，那么就不会裂解红细胞，这时候红细胞是否会产生影响？？
3、孵育抗体的时候，抗体量应该怎样加呢？？以前我用100ul孵育体系来滴定裂红后的白细胞抗体浓度用B220为1.0微升时最合适，那么要是现在我用500ul冲总骨髓细胞的时候，抗体浓度就要用5微升吗？？
4、孵育抗体后能洗吗？
如图二所示：统计骨髓或脾脏中B细胞的绝对计数又是怎样做到的呢？？小鼠脾脏那么大，要全部破碎是用的什么方法呢？？脾脏肯定是要过滤的，过滤的话肯定会有损耗，损耗的问题又怎样解决呢？？抗体的浓度又怎样解决呢？？离心问题又怎样解决呢？？问题有点多，麻烦战友帮忙解释一下，谢谢{:soso__3409329614010722382_4:}{:soso__3409329614010722382_4:}{:soso__3409329614010722382_4:}

小憨

1. 冲出来，做成细胞悬液，吸一点做流式检测。
2. 比例是除去红细胞后的比例，你圈门的时候肯定不红细胞在内的门
3.我都是40 μL体系加0.5~1 μL抗体，更省。500 μL冲骨髓后离心去上清，再重悬就行了。
4. 孵育抗体后一定要洗啊，要不背景会很高的。
5. 脾脏就直接放细胞筛上研磨啊，过滤肯定有损耗，所以要多冲洗。吸取适量细胞，加抗体就行了。

十二郎

小憨 发表于 2015-7-30 15:29
1. 冲出来，做成细胞悬液，吸一点做流式检测。
2. 比例是除去红细胞后的比例，你圈门的时候肯定不红细胞在 ...

回复如下：
1、若裂红的话，图一中B细胞群体占total细胞的百分比我认为就不对了。
2、楼上回答的我懂，我的主要问题是他们是怎样做到的单一群体B细胞绝对计数？？？这个问题不是很明白

niwanmao

十二郎 发表于 2015-7-30 17:44
回复如下：
1、若裂红的话，图一中B细胞群体占total细胞的百分比我认为就不对了。
2、楼上回答的我懂，我 ...

一般流式上所谓的占total比例都是指裂红之后的有核细胞。

至于总数，小鼠脾脏能有多大，全磨掉嘛，然后制备成悬液，至于损耗是不可避免的，但是可以接受的。绝对计数可以采用两种方法：
1、先计数悬液内细胞总量（用计数板），然后再检测某群体比例，相乘即可。
2、加入绝对计数beads，直接进行绝对计数。

十二郎

niwanmao 发表于 2015-7-30 20:57
一般流式上所谓的占total比例都是指裂红之后的有核细胞。

至于总数，小鼠脾脏能有多大，全磨掉嘛，然后 ...

倪老师好，因为以前都是用百分比表示差异，后来看到很多文章也会统计骨髓或脾脏中B细胞的绝对计数，就想请教一下别人是怎样做的。您的意思我也明白。我是这样想的，当小鼠的白细胞裂红后，我一般用250gx5min离心，上清中是否还会有残留的白细胞呢？？我以前做过滴定，一直用100微升孵育体系，大概孵育2x10的6次方个细胞，用1ul抗体。我想当把一整个脾脏研磨的话，若用500ul体系重悬（此时细胞浓度仍然较高），按照抗体滴定理论，此时抗体就要加到5ul了。不是舍不得抗体，只是想用500ul体系加5ul抗体，此时抗体量是否足够，因为一个小鼠脾脏的白细胞是很容易达到8次方的？？？不知道我考虑的对不对？我用的eb公司的抗体，说明书的建议浓度是每100微升孵育体系加2.5ul抗体，细胞数量级是10的6到10的8次方。关于离心后上清是否还有残留白细胞的问题，或许用上清加一下B220的抗体上一下机就知道还有没有残留。

niwanmao

十二郎 发表于 2015-7-30 21:45
倪老师好，因为以前都是用百分比表示差异，后来看到很多文章也会统计骨髓或脾脏中B细胞的绝对计数，就想 ...

你磨一整个脾脏，但是标记和检测只需要取 其中一点点检测就可以了啊，例如你脾脏最后悬液总体积10ml，你取100ul检测，最后测出来这100ul里面有10E5细胞，那么就说明脾脏悬液里面细胞总数是10E7，又省抗体，又能达到目的。

离心后上清几乎不会有残留的白细胞，如果有，那么就是离心机问题。不要纠结这种问题。

十二郎

niwanmao 发表于 2015-7-30 21:50
你磨一整个脾脏，但是标记和检测只需要取 其中一点点检测就可以了啊，例如你脾脏最后悬液总体积10ml，你 ...

看来我又钻牛角尖了   谢谢   顿悟

十二郎

十二郎 发表于 2015-7-30 22:11
看来我又钻牛角尖了   谢谢   顿悟

纠结于采取谁为最佳   倪老师流星已经破万啦   流星就送给上面的小憨战友吧

十二郎

niwanmao 发表于 2015-7-30 21:50
你磨一整个脾脏，但是标记和检测只需要取 其中一点点检测就可以了啊，例如你脾脏最后悬液总体积10ml，你 ...

纠结于采取谁为最佳   倪老师流星已经破万啦   流星就送给上面的小憨战友吧  

小憨

十二郎 发表于 2015-7-30 17:44
回复如下：
1、若裂红的话，图一中B细胞群体占total细胞的百分比我认为就不对了。
2、楼上回答的我懂，我 ...

1，“total”细胞可以不包括红细胞，向外周血用淋巴细胞分离液分离获得的PBMC就不包括红细胞，甚至连粒细胞都没有，一样可以做百分比。另，你做流式肯定要在FSC和SSC中圈门吧，你怎么知道你圈门的时候把所有细胞都圈进去了，所有的细胞碎片都没圈进去？所以“total”细胞是一种非常理想的情况，实际应用中肯定是有损耗的。
2，举个栗子：学校的一个年级有1000人（我所拿到全部细胞的总数），我要统计其中的男生人数和女生人数（目的细胞群）咋办？当然你可以一个一个数，把1000个人挨个数一遍，省事儿的方法是随机抽几个人（就像你从整个脾脏的细胞悬液里吸一点，只要细胞悬液充分混悬均匀，就是随机抽样），看一下其中男生有50%，那这个年纪里男生大概就在500人左右呗。另外一种情况，我不知道这个年纪一共有多少人（就像我们拿到一个脾脏的细胞悬液也不会先去计数），但是我知道一共有多少个班级（细胞悬液的体积肯定是知道的，我一般都是放固定体积的液体重悬细胞），我随机挑一个班（比如吸取100 μL），算一下其中男生有多少人（有的流式细胞仪可以做到吸取固定体积的样品，比如C6就可以。其他流式可能就要借助计数微球了），那×班级数，那就能大概知道一共有多少男生了。
另外，我还想强调一下，绝对数中的“绝对”，不是指绝对准确一个不差，而是对应相对数（百分比）来的。就算你移液时没有任何一点细胞悬液贴壁，离心把所有细胞都离下来了，你把细胞从体内取出到体外来，总会有死的吧，这些根本就没有方法避免。