小鼠红细胞裂解求改进方法

zhonjer

如题，本人近期尝试裂解小鼠全血样本以获得中性粒细胞，由于每次样本量较少（最多50ul），所以无法像有些裂解方案那样先离心去红细胞再用上清裂解。我用的是碧云天的红细胞裂解液，按10倍体积加入，裂解2~3min后4℃离心500g 5min，弃上清，1*PBS重悬。目前在裂解之前先用CD45标记白细胞，但是发现离心完后沉淀仍是红色的，上流式结果则显示中性粒占CD45阳性细胞10~40%，每次结果波动也较大。由于查资料似乎小鼠粒细胞占白细胞比重应该是30~40%，所以想求助各位大侠，这样的情况是什么原因？是否有可以改良的办法？

十二郎

论坛直接搜索氯化铵就有配方了

zhonjer

十二郎 发表于 2015-8-19 09:02
论坛直接搜索氯化铵就有配方了

论坛的配方是人的

niwanmao

zhonjer 发表于 2015-8-19 14:12
论坛的配方是人的

氯化铵裂解液并没有局限于人，都可以用，但是某些情况下某些标本可能耐溶，可以考虑多次裂解。

zhonjer

niwanmao 发表于 2015-8-19 15:08
氯化铵裂解液并没有局限于人，都可以用，但是某些情况下某些标本可能耐溶，可以考虑多次裂解。 ...

嗯，谢谢倪老师，但是我裂解中出现的情况是不是有裂解太厉害的原因才导致中性粒比例下降？还是因为裂解离心导致中性粒sslin下降导致与淋巴细胞无法分离？

niwanmao

zhonjer 发表于 2015-8-19 15:57
嗯，谢谢倪老师，但是我裂解中出现的情况是不是有裂解太厉害的原因才导致中性粒比例下降？还是因为裂解离 ...

如果出现比例降低，一方面可能是由于小鼠个体差异，另一方面也可能是由于离心后去上清的操作。裂解本身不太会造成粒细胞破碎。

明珠

您用的是碧云天，C3702(Red Blood Cell Lysis Buffer)裂解液吗？我用的BD 555899，室温裂解两次约30min，还是有明显的红色。小鼠的外周血裂红效果不好，希望有相关经验的老师多提提意见。

wxd

我们用过两种红细胞裂解液，分别是ebioscience的0-4333-57和索莱宝的R1010。ebioscience的说明书上说的是4℃裂解10-15 min，但是我们做的效果不好，之后改成了先将红细胞裂解液放到37度水浴30 min，效果好了一些，但还是裂红不彻底。加上这个裂解液用量大而且价格贵，就换成索莱宝的了。索莱宝的说明书上没写用什么温度裂红，但我们试了4度，效果还不如ebioscience的，改成37度预孵育30min裂解液，达到了裂红彻底的效果。所以温度应该是影响裂红效果的重要因素。
另外抗凝剂也是影响裂红效果的另一个重要因素，根据我们的实验，EDTA2K的裂红效果最好，肝素钠枸橼酸钠的裂红效果不理想。

明珠

wxd 发表于 2024-5-30 08:41
我们用过两种红细胞裂解液，分别是ebioscience的0-4333-57和索莱宝的R1010。ebioscience的说明书上说的是4 ...

谢谢您的分享。BD 555899这款裂解液，我们也做了37℃孵育，效果还不如室温裂解的好，还在犹豫要不要做4度这个条件。

wxd

可以用大龄废老鼠试试。也可以考虑联系厂家技术支持、更换产品品牌等其他的解决方法。