鼠脾淋巴细胞CD4CD25染色流式分析结果

王娟

大家能不能帮我分析分析我的流式数据：我做的是用ConA和细胞因等刺激小鼠脾淋巴细胞48h，加药作用后，看药物对抑制性T细胞CD4+CD25+的比例，但是我做了几次，发现刺激过后的脾细胞总是很分散，所以我不知道在FSC-SSC应该如何设门，以及如何调节补偿，这次结果是用ConA刺激的，我感觉是刺激起来了。我是用Beckman的Mflo XDP仪器做的，CD4-PE,CD25-PE-Cy7染色。结果在附件中麻烦大家帮我分析分析，急求……

niwanmao

看了下，这几个经过刺激的细胞均可见如上图的现象，红色为CD4+淋巴细胞，绿色是随便圈的一块，疑似死细胞或活力不佳细胞。结果很明显，两类在FSC/SSC散点图上重叠的，所以无法通过FSC/SSC设门。

建议解决方法：
1、加CD3抗体，用CD3抗体设门，代替FSC/SSC。
2、加live/dead染料，排除死细胞。

王娟

niwanmao 发表于 2015-8-20 21:33
看了下，这几个经过刺激的细胞均可见如上图的现象，红色为CD4+淋巴细胞，绿色是随便圈的一块，疑似死细胞 ...

倪老师，加了CD3抗体之后还要加live/dead染料，排除死细胞吗？如果两个都加的话可能补偿就不好调了，就是四色的了，CD3是FITC染料，CD4-PE,PI,CD25-PE-Cy7.

小憨

王娟 发表于 2015-8-21 08:46
倪老师，加了CD3抗体之后还要加live/dead染料，排除死细胞吗？如果两个都加的话可能补偿就不好调了，就是 ...

把细胞刺激后再用ficoll分一下，可以去除细胞碎片

niwanmao

王娟 发表于 2015-8-21 08:46
倪老师，加了CD3抗体之后还要加live/dead染料，排除死细胞吗？如果两个都加的话可能补偿就不好调了，就是 ...

加live/dead比较好，如果确实只有4色，那么只用CD3，就象@小憨  所说的，离心或者ficoll提取可以减少碎片。

王娟

小憨 发表于 2015-8-23 11:08
把细胞刺激后再用ficoll分一下，可以去除细胞碎片

非常感谢您的建议，对于您所说的刺激后再ficoll处理，是说在上机染色之前，再分吗？不知您是否做过小鼠脾淋巴细胞体外培养，为什么我加刺激培养48h后，细胞总是死亡很多，所以流式分析的数据总是一团糟。

小憨

王娟 发表于 2015-8-24 21:05
非常感谢您的建议，对于您所说的刺激后再ficoll处理，是说在上机染色之前，再分吗？不知您是否做过小鼠脾 ...

我建议是刺激完以后用ficoll分，然后染色。因为染色用不了多少细胞，再用ficoll分可能留不下多少细胞了。
淋巴细胞培养我做过很多，小鼠人的都做过。淋巴细胞就是这样，只要不给他存活信号（比如IL-2）他就去死了，没有其他细胞那样的中间状态。我自己感觉淋巴细胞不是增殖就是凋亡，很少能保持它的静息状态。
PMA和Ion刺激一般还可以，不至于死很多，但是时间不要很长，容易引起AICD，即活化诱导的凋亡，我自己的经验6 h足矣，超过8 h这两种药就会对细胞表现出毒性了。像你的48 h就太长时间了。

王娟

小憨 发表于 2015-8-25 08:16
我建议是刺激完以后用ficoll分，然后染色。因为染色用不了多少细胞，再用ficoll分可能留不下多少细胞了。 ...

8h就可以刺激鼠淋巴细胞增殖吗？因为我是要分析刺激后脾淋巴细胞中抑制性细胞种群即CD4+CD25+。刺激8h能够刺激其增殖吗？因为文献上说都是刺激72h的，但是72h死的更多，所以我才改成了48h，不知道您有没有做过抑制性细胞种群，8h能刺激起来吗？如果可以的话，我就改为8h了，这个实验也折磨我很久了，每次都是细胞死亡很多，但是也明显看见细胞聚团，可能就是发生了ACID，再次感谢您的回答，急求……

小憨

王娟 发表于 2015-8-27 09:47
8h就可以刺激鼠淋巴细胞增殖吗？因为我是要分析刺激后脾淋巴细胞中抑制性细胞种群即CD4+CD25+。刺激8h能 ...

检测细胞因子分泌的话几个小时就够了，如果是检测增殖的话时间就得长一点了。
我之前是将T细胞分选出来，用CD3和CD28刺激，48小时就有很明显的增殖了（CFSE法）；如果是PBMC或者是裂红后的脾细胞直接刺激的话，可能需要延长刺激时间，但是注意不能单独将CD4或CD8分选出来刺激，这样是不能引起细胞增殖的。conA的话我是没做过，PMA和Ion的话时间长了会有毒性，我觉得你可以考虑一下用CD3和CD28

王娟

小憨 发表于 2015-8-27 18:40
检测细胞因子分泌的话几个小时就够了，如果是检测增殖的话时间就得长一点了。
我之前是将T细胞分选出来， ...

那能不能问问您，一般分选出来的细胞在几孔板中培养呢？种多少细胞呢？我觉得会不会细胞数量多少也会影响细胞存活？我现在一般都是24孔板，种200万细胞。再次感谢。