表面Kappa和Lambda染色，需要洗涤多少次才能做出好结果？

niwanmao

检测B淋巴细胞增殖性疾病表面的单克隆轻链表达对于诊断和残留病灶监测都十分重要 [1]。在正常B细胞群中，Kappa和Lambda的比例大约1.5:1或1:1.5，而B细胞淋巴瘤的肿瘤细胞通常会表现为某一轻链的克隆性表达，一般kappa:lambda比例>3:1或<0.3:1被认为是单克隆性表达 [2, 3]。

但是在实际检测过程中，会碰到不少难题，其中难题之一就是非B细胞与轻链抗体结合，导致非B细胞的非特异性染色（例如NK细胞、T细胞、单核细胞、粒细胞表面的Fc受体结合游离球蛋白，再结合轻链抗体；死细胞非特异性结合），难题之二就是血浆中的游离免疫球蛋白结合轻链抗体，导致检测结果假阴性。现已证明，标记抗体前事先用等渗溶液洗涤可去除血浆中的游离免疫球蛋白并减少非特异性染色[4, 5]。

那么问题来了，究竟洗涤多少次才能使洗涤次数尽可能少，避免时间浪费，同时又使轻链染色效果达到最佳呢？这里我们做一下实验。

实验设计：
10个不同标本（包括6例外周血、4例骨髓），每例标本洗涤4次，分别在第1、2、3、4次洗涤后检测其轻链表达。
抗体为kappa FITC、lambda PE、CD19 ECD、CD45 PC7。


数据分析：
每次检测，利用CD45选择淋巴细胞，然后均分析CD19+的B细胞表面轻链表达的阳性率、平均荧光强度（MFI）、信噪比（S/N）、阴性峰的SD值、染色指数（SI）等参数。
信噪比= 阳性峰MFI ÷ 阴性峰MFI
染色指数＝（阳性峰MFI－阴性峰MFI）÷（2×阴性峰SD）



图1. 正常外周血的Kappa、Lambda表达，Kappa表达用天蓝色表达，Lambda表达用粉色表达，所有表达均为CD19+B细胞。从左到右依次是洗涤1次、洗涤2次、洗涤3次、洗涤4次。

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作者 : Zachary Britt, Melanie O'Donahue and Domenica Mills
编译：流式中文网（倪万茂）

参考文献
1.Marti, Gerald E., Andy C. Rawstron, Paolo Ghia, Peter Hillmen, Richard S. Houlston, Neil Kay, Therese A. Schleinitz, and Neil Caporaso. "Diagnostic Criteria for Monoclonal B-cell Lymphocytosis." British Journal of Haematology Br J Haematol 130.3 (2005): 325-32.

2.Fukushima, Paula I., Phuong Khanh Thi Nguyen, Paul O'grady, and Maryalice Stetler-Stevenson. "Flow Cytometric Analysis of Kappa and Lambda Light Chain Expression in Evaluation of Specimens for B-cell Neoplasia." Cytometry 26.4 (1996): 243-52.

3.Ewa Bajor-Dattilo, Katherine R. Calvo, Raul C. Braylan, Martalice Stetler-Stevenson, and Constance M. Yuan. Low Grade B-cell Lymphomas [PDF document]. Lab of Pathology NCI/NIH, Hematology Division CC/NIH Bethesda, MD. Retrieved from http://www.cytometry.org/public/ ... sentations/Yuan.pdf

4.Craig, Fiona E., and Kenneth A. Foon. "Flow Cytometric Immunophenotyping for Hematologic Neoplasms." Blood 111.8 (2008): 3941-3967.

5.Kalina, T., J. Flores-Montero, V H J Van Der Velden, M. Martin-Ayuso, S. Böttcher, M. Ritgen, J. Almeida, L. Lhermitte, V. Asnafi, A. Mendonça, R. De Tute, M. Cullen, L. Sedek, M. B. Vidriales, J. J. Pérez, J. G Te Marvelde, E. Mejstrikova, O. Hrusak, T. Szczepa?ski, J. J M Van Dongen, and A. Orfao. "EuroFlow Standardization of Flow Cytometer Instrument Settings and Immunophenotyping Protocols." Leukemia 26.9 (2012): 1986-2010. Web.

ohjaw

{:soso_e179:}太棒了，这个问题困扰我很久了，我之前有比对过三遍和四遍，但是没有进行倪老师这样分析，主观认为它们没有明显差异。

RIVA

不知道，您有没有试过先溶血后计数染色，感觉KAPPA/LAMMDA，也能做出来哦~

niwanmao

RIVA 发表于 2015-8-28 13:43
不知道，您有没有试过先溶血后计数染色，感觉KAPPA/LAMMDA，也能做出来哦~

先溶血后染色，效果类似于洗涤1次，可能部分会做出来，但效果肯定不如三次的好。

FCMao

表面kappa/Lambda除了洗涤次数还需要注意什么呢？抗体方面有要求吗？我看到有的医院直接都破膜，不管胞内还是薄膜，这样好吗？谢谢倪老师。

niwanmao

FCMao 发表于 2015-9-16 11:19
表面kappa/Lambda除了洗涤次数还需要注意什么呢？抗体方面有要求吗？我看到有的医院直接都破膜，不管胞内还 ...

如果做表面标记，尽量别破膜。

kappa、lambda洗涤次数注意外，尽量用10倍体积PBS洗涤。

happyeday

niwanmao 发表于 2015-9-16 12:55
如果做表面标记，尽量别破膜。

kappa、lambda洗涤次数注意外，尽量用10倍体积PBS洗涤。 ...

如果一份血样，除了kappa和lambda外，还检测其他的项目，如CD38，zap70，分三管染色。那是否可以样品先洗涤三次后，然后分三份检测其他的maker？

niwanmao

happyeday 发表于 2020-6-3 12:50
如果一份血样，除了kappa和lambda外，还检测其他的项目，如CD38，zap70，分三管染色。那是否可以样品先洗 ...

当然可以。洗涤不影响其它抗原。

happyeday

niwanmao 发表于 2020-6-3 14:08
当然可以。洗涤不影响其它抗原。

好的，谢谢您！我就是担心会丢细胞，影响比例。