流式细胞术胞内染色需要设置哪些对照？

niwanmao

对照，能够帮助我们在流式实验中确定实验结果是否可靠、准确。仔细设置对照很关键。在流式实验中，我们要综合考虑众多因素，基于此，我们推荐在日常流式实验中规范性使用以下对照：
一、设置仪器用的对照，主要是各类仪器使用的标准微球，例如BD的Calibrite 3、CS&T等，Beckman的FlowCheck等，可用于检查仪器状态；还有一些补偿微球，可帮助调整仪器的电压和补偿。
二、设门对照，用于区分特异性和非特异性结合。
三、实验对照，用于提供生物学本底信息或者阳性对照等。

下面列出各类对照及其应用意义，尽管种类繁多，但实际上都属于上面三大类，大家在设计实验时可选择性应用其中的一种或多种。
1、未染色的细胞
确定背景和自发荧光的阴性对照；设置PMT电压。

2、完全染色的细胞
确定一些超出坐标轴的事件；设置PMT电压。

3、单染的细胞/微球
调节补偿

4、同型对照
设门，用于消除同类抗体的非特异性染色

5、荧光扣除对照（FMO）
设门，用于消除荧光渗漏荧光的背景

6、未刺激或未处理的样本
实验阴性对照

7、阳性细胞（刺激或特殊药物处理过的）
实验阳性对照

8、用细胞活性染色（例如PI等）标记细胞
区分死、活细胞。

decade911

倪老师，405nm激发的PE-CY7与633nm激发的Life公司的一款Live/Dead染料的荧光光谱几乎完全重合。我记得流式书上说不同激光器激发的荧光不会溢漏，那这两种完全重合的荧光素能共用吗？

niwanmao

decade911 发表于 2015-9-15 19:56
倪老师，405nm激发的PE-CY7与633nm激发的Life公司的一款Live/Dead染料的荧光光谱几乎完全重合。我记得流式 ...

PE-cy7应该488nm激发的，不是405
而且live/dead有很多种激发和发射波长染料可以选择，不是只有一种的

decade911

niwanmao 发表于 2015-9-15 20:05
PE-cy7应该488nm激发的，不是405
而且live/dead有很多种激发和发射波长染料可以选择，不是只有一种的{:1_ ...

不好意思，打错了。我是多色配色下来，只剩下个633nm激发，780/60nm通道了。不知道这两种能不能共用。发射光谱完全重合，但激发光源不同，收集光路也不一样，按理说应该是可以的。
另外405nm激发，荧光染料V450与V500能共用吗？一个走450/40通道，一个走530/30通道。前者溢漏到后者多些，后者对前者几乎没有溢漏。
学校机器是5-2-2的配制，我得配7色，够呛啊。

niwanmao

decade911 发表于 2015-9-15 20:21
不好意思，打错了。我是多色配色下来，只剩下个633nm激发，780/60nm通道了。不知道这两种能不能共用。发射 ...

V450和V500可以共用，补偿调节一下即可。

decade911

niwanmao 发表于 2015-9-16 08:06
V450和V500可以共用，补偿调节一下即可。

谢谢倪老师。那488nm激发的PE-CY7与633nm激发的Life公司的一款Live/Dead染料的荧光光谱几乎完全重合，那这两种完全重合的荧光素能共用吗？
谢谢！

niwanmao

decade911 发表于 2015-9-16 09:47
谢谢倪老师。那488nm激发的PE-CY7与633nm激发的Life公司的一款Live/Dead染料的荧光光谱几乎完全重合，那 ...

可以用的，检测通道不一样。

lmy0929

老师，想问一下，如果做K562细胞内的间标，阳性对照、阴性对照，分别怎么设置？还需要注意些什么？麻烦老师了。

watch_77

倪老师，想请教一下，做Annexin/PI双染检测凋亡时，未染色的对照或者单染对照使用的细胞是用凋亡诱导剂处理过的细胞还是用未处理的细胞？

niwanmao

watch_77 发表于 2018-8-6 17:48
倪老师，想请教一下，做Annexin/PI双染检测凋亡时，未染色的对照或者单染对照使用的细胞是用凋亡诱导剂处理 ...

你要检测的是处理过的细胞，所以对照也应该用处理过的细胞。