请问用全血和PBMC标Treg在标Foxp3时步骤有什么区别吗？

niwanmao

标题：请问用全血和PBMC标Treg在标Foxp3时步骤有什么区别吗？

回答者：niwanmao[

1. 如果有表面标记，先进行表面标记。
2. 全血，进行红细胞裂解，PBMC这一步可以省略。
3. 进行FoxP3染色，详细步骤参见Kit的说明书，我这里附一份BioLegend的说明书：
   1. Prepare 1X working solutions of FOXP3 Fix/Perm buffer and FOXP3 Perm buffer prior to staining. The FOXP3 Fix/Perm buffer (4X) must be freshly diluted by diluting one (1) part FOPX3 Fix/Perm buffer (4X) with three (3) parts PBS. The FOXP3 Perm buffer (10X) should be diluted by diluting one (1) part FOXP3 Perm buffer (10X) with nine (9) parts of PBS.
   2. Add 1 ml of 1X FOXP3 Fix/Perm solution to each tube, vortex and incubate at room temperature in the dark for 20 minutes, then spin down the cells and remove supernatant.
   3. Wash once with cell staining buffer (Cat. No. 420201) by spin at 250 x g for 5 minutes and remove supernatant.
   4. Wash once with 1 ml 1X FOXP3 Perm buffer.
   5. Re-suspend cells in 1 ml 1X FOXP3 Perm buffer, incubate at room temperature in the dark for 15 minutes, spin down cells and discard the supernatant.
   6. Add 5 μl per tube of Alexa Fluor ® 488 anti-mouse/rat/human FOXP3 antibody, or Alexa Fluor ® 488 mouse IgG1, κ isotype control to the appropriate tubes, incubate at room temperature in the dark for 30 minutes.
   7. Wash twice with cell staining buffer, and re-suspend in 0.5 ml cell staining buffer then analyze with flow cytometer with appropriate instrument setting.
      
      

2009年8月12日 0:54

范晋波

小鹿 发表于 2020-5-7 10:05
那老师测这些胞内因子的不用特定破膜的试剂盒，如果只用4%多聚甲醛固定，皂素破膜可不可取呢？如果要测TH ...

倪老师之前发过类似的内容，小鼠和人的CD4会在刺激剂刺激后表达丢失，所以建议使用CD3和CD8反圈；如果想保证实验结果的话，最好TH1/2一管做，TH17另外一管做，因为两者所需的刺激时间不一样，TH1/2一般4-6小时；TH17我们一般刺激12小时再做

niwanmao

小鹿 发表于 2020-5-7 10:05
那老师测这些胞内因子的不用特定破膜的试剂盒，如果只用4%多聚甲醛固定，皂素破膜可不可取呢？如果要测TH ...

这样做是可以做，但是皂素的浓度比较难摸索，而且需要额外裂红。

范晋波

小鹿 发表于 2020-5-6 16:21
老师，那刚取出的抗凝全血测：胞内因子的例如TH1/TH2/TH17需要刺激剂刺激的细胞群，需要先用红细胞裂解液 ...

全血刺激，刺激完用eb的破膜剂，他们的固定剂可以直接将红细胞裂解掉，而且破膜的效果很好

1060990080

倪老师，用人全血分离淋巴细胞做Treg，用血量大概多少呢？孵抗体前要求细胞悬液浓度是10*7/ml~

niwanmao

1060990080 发表于 2017-7-19 21:46
倪老师，用人全血分离淋巴细胞做Treg，用血量大概多少呢？孵抗体前要求细胞悬液浓度是10*7/ml~ ...

一般不建议分离PBMC，对于这些稀有亚群，容易造成细胞丢失。这个帖子是当年回答一位站友时写的。

1060990080

http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... ypeid%26typeid%3D35
倪老师，是参考这个贴吗？ 全血之后进行红细胞裂解？我们是要做Treg的、我所看的文献用血量都好多啊（先进性淋巴细胞分离再表染破膜）

上述链接的贴竟然只用了200ul全血就能搞掂？感觉这样本量差了不止一点半点啊，不知是不是我理解错了~~

niwanmao

1060990080 发表于 2017-7-20 09:35
http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=3039&extra=page%3D1%26filter%3Dtypeid%26type ...

我们平时用100ul。

1060990080

100ul 全血就能收集到细胞悬液浓度是10*7/ml？表示不可思议啊~倪老师，请问有相应的protocal吗？想参照一下呢~~

niwanmao

1060990080 发表于 2017-7-20 16:15
100ul 全血就能收集到细胞悬液浓度是10*7/ml？表示不可思议啊~倪老师，请问有相应的protocal吗？想参照一下 ...

正常人白细胞5×10E9/L，那么就是5×10E6/ml，淋巴细胞占20～30％，算25％，那么就是1.25×10E6/ml，你如果一定要求浓度是10E7/ml，只要离心去掉上面的血清，基本上就能达到了，10E7/ml是细胞浓度，并非细胞总量。

然而，实际上，并没有这种硬性规定，只要你最终的淋巴细胞总数能够取到数万，就足够你分析了。

1060990080

嗯呢，谢谢倪老师！！！

1060990080

倪老师，你看看我的设计对不对：取100ul抗凝全血先做表面标记（如我做的Treg，就先将CD3、CD4、CD25一起孵育），然后进行红细胞裂解，最后染Foxp3。
实验设计：
空白管：即仅仅是用100ul抗凝全血做红细胞裂解所得白细胞悬液；
表面标记管：100ul抗凝全血与表面标记抗体一同孵育（CD3、CD4、CD25），然后红细胞裂解制备成悬液
破膜管：即在表面标记管基础上进行后续破膜、孵Foxp3抗体

此处不知是否有必要增加Foxp3同型对照管??

niwanmao

1060990080 发表于 2017-7-20 21:33
倪老师，你看看我的设计对不对：取100ul抗凝全血先做表面标记（如我做的Treg，就先将CD3、CD4、CD25一起孵 ...

1、直接做破膜管。
2、如果你的foxP3分群不清，需考虑破膜剂或foxP3质量