用两种方法分离小鼠脾脏淋巴细胞，流式检测T亚群的结.

winnebenben · 发表于 2015-10-21 23:50:23

本帖最后由 winnebenben 于 2015-10-22 12:35 编辑

我们实验室最近在做小鼠脾脏淋巴细胞的实验，检测项目有T淋巴细胞亚群，记忆性T细胞和细胞因子等，前期我们使用两种方法来分离小鼠脾脏淋巴细胞，一种是使用淋巴细胞分离液，一种是直接用溶血素裂红，用流式检测得出的结果，首先CD3+的百分比不同，溶血素是30%左右，淋巴细胞分离液是24%左右，其次CD3+CD8+和CD3+CD4+两群细胞的比例也不同，下面分别是两种方法的流式结果。

1、溶血素方法分离的小鼠脾脏淋巴细胞的CD3+细胞比例和CD3+细胞里CD4+和CD8+细胞的比例

溶血素CD3

溶血素CD4,CD8

2、淋巴细胞分离液分离的小鼠脾脏淋巴细胞的CD3+细胞比例和CD3+细胞里CD4+和CD8+细胞的比例

淋巴细胞分离液CD3

淋巴细胞分离液CD4,CD8

是我们的淋巴细胞分离液有问题吗？做了很多次都是这样，每次都是用同一只小鼠的脾细胞来做,感觉溶血素方法做出来的结果比较可靠,这个问题该怎么解决？求解，谢谢！

niwanmao · 发表于 2015-10-21 23:50:24

奇怪，这个问题为什么前两天没看到呢。

确实如此，溶血素法的优点就是保留所有细胞成份，缺点是容易受到红细胞和碎片干扰；Ficoll分离法的优点是细胞比较干净，红细胞和碎片基本上被去光了，但是一方面容易丢失细胞，另一方面可能对有些细胞活性有影响。

一般情况下，能用溶血法的尽量用溶血。

chymanhz · 发表于 2015-10-25 08:42:01

上周刚做了这个实验，不过用的人血，结果和你的趋势差不多。应该是方法学的原因，不是操作问题。

winnebenben · 发表于 2015-10-26 12:24:23

niwanmao 发表于 2015-10-21 23:50
奇怪，这个问题为什么前两天没看到呢。

确实如此，溶血素法的优点就是保留所有细胞成份，缺点是容易受到红 ...

好的，谢谢倪老师

winnebenben · 发表于 2015-10-26 12:24:57

chymanhz 发表于 2015-10-25 08:42
上周刚做了这个实验，不过用的人血，结果和你的趋势差不多。应该是方法学的原因，不是操作问题。 ...

明白了，谢谢

小憨 · 发表于 2015-10-27 08:21:55

溶血素保留粒细胞；而ficoll粒细胞没有保留，而且有些T细胞亚群可能会丢失。
我个人是觉得还是ficoll对细胞状态影响小。
从你的结果看，就算是gate在CD3里，CD4和CD8的比例在两种方法中还是不一样的，说明这两种方法确实会对T细胞某些亚群的分选具有选择性，看来ficoll真的会使CD4T细胞的某些亚群丢失。
非常有用的结果，感谢分享！

小憨 · 发表于 2015-10-28 20:33:42

我最近要做分选，在准备的时候突然想起一个问题，淋巴细胞分离液也就是ficoll是专门用来分选人细胞的，小鼠有自己单独的分离液，其比重与ficoll是不一样的。记得我曾经用ficoll去分过小鼠的脾细胞，结果得到的细胞非常少，肯定有一大部分损失了。

味海医心 · 发表于 2015-11-1 15:52:24

小憨发表于 2015-10-28 20:33
我最近要做分选，在准备的时候突然想起一个问题，淋巴细胞分离液也就是ficoll是专门用来分选人细胞的，小鼠 ...

人的是1.077，小鼠是1.083，有各自不同的分离液

小憨 · 发表于 2015-11-2 10:46:05

味海医心发表于 2015-11-1 15:52
人的是1.077，小鼠是1.083，有各自不同的分离液

所以用ficoll分小鼠脾脏，最后剩下的肯定不是淋巴啊

winnebenben · 发表于 2016-6-7 20:49:40

不好意思忘记说明了，我们用的淋巴细胞分离液是sigma的Histopaque®-1083，就是用来分离鼠及小型哺乳动物的淋巴细胞的，试过Balb/C和C57小鼠两种小鼠,结果都差得不多.

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