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平常,经常会碰到一些在FSC/SSC或者其它散点图上分群不清的情况,这时,如何圈中目的细胞而不会将干扰细胞选进去,对于分析结果准确与否十分关键。如果你在其中加入了某个特异性的标记能够选出该类细胞,那么采用“反设门”(backgating)是个靠谱的方法。
其实以前论坛上很多FLOWER也都问过究竟什么是“反设门”,费尽口舌,但还是应该有不少新手不了解,所以在此结合图形解释一下“反设门”的概念。
先看下面这个图,箭头指向代表我们要解释的顺序,A图是未设门的散点图(此处SSC采用了LOG,可能有些站友看不惯,没关系,其实LOG只是把几群细胞的间距拉近了、压扁了,分布还是一样的),从A图可看出,淋巴细胞和单核细胞分群不是特别清,其中稍微有点交叉在一起,此时,我设淋巴细胞的门应该边界怎么设置可以防止单核细胞的干扰呢?
对了,就是反设门,B图开始就是反设门的步骤,首先选择CD45高表达并且CD14阴性的细胞,设为P1门,门内就是很纯粹的淋巴细胞了,将P1门内细胞显示在FSC/SSC散点图上,可以看到,确实淋巴细胞有些拖尾拖到单核细胞区域内,于是我们就知道了,要避开那些零零散散的拖尾,选择单纯的淋巴细胞群体,设为P2。再去看P2门内的细胞,就能够看到P2门内的细胞是很纯的淋巴细胞,只有0.3%的单核细胞干扰。
聊到这里肯定又有站友要问了,这样圈不是损失一些淋巴细胞信号了吗?确实会损失,但是比较少。另外,其实我们还可以利用CD45/SSC很好地区分开淋巴细胞和单核细胞。但是我们今天其实不是讨论淋巴细胞的设门方法,只是借此案例,告诉大家什么是“反设门”,反设门是怎么用的,怎么来帮助我们来选择更纯的目标细胞,仅此而已。☰☱ |
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