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发表于 2015-12-3 14:36:29
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嗯，我大致介绍一下流式细胞仪分选相关的知识吧
倪老师说了，分选效率和分选纯度是很重要的性能指标。
分选纯度很简单，是你最后得到的细胞当中，有百分之多少是目标细胞。分选完了之后，立即再用分选得到的细胞上样一检测就可以知道了。
分选效率：一般所说的分选效率应该是指分选门内有百分之多少的细胞被仪器分选出来。这个与你设定的分选模式、跑样速度、仪器液滴震荡频率、目标细胞的百分比、电子系统性能等都有关系。
分选模式影响很大：
富集模式下，只要有符合要求（分选门里的细胞）的细胞，那么不管是不是同时还存在非目标细胞，仪器都会将其分选出来。（通常可以用于分选很低比例的细胞，保证得到足够数量的目标细胞，这时纯度会有所降低，但分选顺利的话依然是能够达到到90%，95%甚至97%纯的，当然与样本有关）。
纯度模式下，一个液滴中只有目标细胞且没有非目标细胞，而且离这个目的细胞前后一定范围（可以设定）没有非目标细胞，它才会被分选。通常都是用纯度模式。
单细胞模式就更严格了，目标细胞必须位于液滴中间位置，前后液滴没有其它细胞，才会被分选。一般用于多孔板单克隆分选，长单克隆的。
主要是这三种模式，还有一些介于这三种之间的组合。
液滴震荡频率，就是每秒钟产生多少个液滴。如70um的喷嘴一般能到80KHZ左右，就是每秒钟8万个液滴。显然，跑样速度不能高于这个数，否则就不是一个液滴一个细胞了。当然，低于这个数值的跑样速度也不能就一定保证一个液滴一个细胞，因为细胞间的间距是随机的，还会粘连，因此有空液滴，也有两三个细胞一个在一个液滴中的。另外，仪器一般会“看”前、中、后三个液滴，根据你的分选模式做出分选决定。（如，纯度模式下，细胞靠近液滴上端，且后一个液滴没有非目标细胞，仪器会把这两个液滴都分选出来，以保证一定能得到这个细胞。因为液滴断裂时这个位置的细胞也可能位于后一个液滴中）。跑样太快了，被仪器丢弃的细胞就会多，分选效率就下来了（但分选速度仍会增加，看你的取舍了）。告诉你一个适用的经验，一般情况下，跑样速度控制在震荡频率的1/4-1/3能较好保证效率（当然，你一定要自己多观察。目标细胞比例太低，分选效率也会降低，这时要保证效率就要减速了。不同仪器电子系统性能不同，同等情况下效率也不相同，这些都需要操作者观察积累经验，根据具体样本和实验目的来操作。）
分选的回收率：就是最终你得到的目标细胞占样本中目标细胞的百分比。回收率跟分选效率不太一样，并不是仪器显示分选出了多少个细胞，你就得到了多少个细胞，实际得到的细胞数量要比它少。例如，细胞如果死亡严重会让你损失很多细胞。有的仪器容易分选出空液滴，实际得到的细胞数量偏离仪器显示的分选细胞数目更远，各种因素加起来，可能你得到的细胞数目还不到仪器计数的1/3，甚至更低。
所以细胞活性也很重要，除非你不管死活。用不同尺寸的喷准分选不同大小的细胞，除了防止堵塞，另一个目的就是提高细胞活性。细胞在流式上跑样时是会受到损伤的（不要听厂商销售说的分选对细胞没有影响。）。有的分选仪就优化了对细胞活性的保护，可以非常好的保证脆弱细胞的存活。（例如，据我所知，脆弱的神经干细胞都能有90%的存活，其它条件当然也要配合才行，这玩意可是放到PBS里就会死的。）不同尺寸的喷嘴对应的液滴振荡频率不同，能达到的分选速度有很大差异。尺寸越大，鞘液压力越低，液滴频率越低，最大分选速度就越低，但细胞活性越好。
分选速度也是个重要的性能指标。了解了液滴频率，其实就可以明白，物理规律都一样，不同仪器能达到的液滴频率也基本差不多，只要不是太差，同等情况实际分选速度不会相差很大。（高分选效率和回收率的仪器当然可以适当提高分选速度）。
综合各方面性能来考虑，不同分选仪差别是蛮明显的。
96孔板分选，不用管细胞大小，就用100um或以上的喷嘴吧，单细胞模式分选。这个分选又基本不要求速度。
液流稳定性和落点问题，仪器机械性能当然很重要，这个改变不了，但一般都是非常可靠。仪器所处环境温度波动会有影响较长时间的实验。喷嘴是否有瑕疵，调节的分选液流质量，鞘液罐是有点否漏气，过滤器是否有气泡，喷嘴是否干净，分选模式是否合适这几个方面可以考虑。
只要各个地方都没有问题，分选仪是会非常稳定的！ |
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发表于 2015-11-24 20:14:30
