荧光补偿怎么判断是否需要调节？

丰登

倪老师，您好：

想跟您请教一个有关荧光补偿的问题：

我们最近在做Human 全血 Treg检测。染色为CD3-FITC, CD8-PerCP-PE cy5.5， CD25-APC, Foxp3-PE.

附件是我的结果图。我的问题：
1. 我想分析CD4+ 阳性群中的CD25+,FoxP3+双阳性的Treg：从FITC和PE的图看，电压和补偿没有调好；但是相比同型对照，能看出有CD3+FOXP3+; 这是否说明FoxP3染上了呢？
2. 结果看CD4+CD25+Foxp3+ 的阳性细胞却没有；如果我不调节FITC补偿和电压，难道会影响CD4群中treg的比例（我可以正常圈出CD4阳性细胞）？
3. 如果影响，但我可以圈出CD4+的细胞群，而且APC和PE的补偿看着是正常的呢。是否说只要我想分析的两个通道间补偿调节合适，其他通道补偿是否调节都不影响结果呢？


万分感谢啊！

niwanmao

第二个foxP3和CD3的图你把所有细胞都显示出来看看，我总觉得你PE通道的电压是不是调低了点

丰登

我上机的时候，没看这张图。后来用flowJo分析的时候，发现这个问题，而且无法调节坐标轴，这部分细胞也显示不出来。（BD Calibur）

但是从PE和APC的图上看，PE通道的电压也不低呢。

niwanmao

丰登 发表于 2016-1-25 10:36
我上机的时候，没看这张图。后来用flowJo分析的时候，发现这个问题，而且无法调节坐标轴，这部分细胞也显示 ...

FL2和FL4的图因为不存在补偿，不准确，你看为什么FL2看起来还可以，因为你在FL1和FL2散点图上可能存在的补偿未调节到位导致的上翘，所以使FL2看起来貌似电压可以。

丰登

谢谢倪老师。那我不调节FITC和PE的补偿和电压，但是我可以顺利分析CD4+, 是否会影响FOXP3+CD25+ 的treg的结果呢？

niwanmao

丰登 发表于 2016-1-25 21:07
谢谢倪老师。那我不调节FITC和PE的补偿和电压，但是我可以顺利分析CD4+, 是否会影响FOXP3+CD25+ 的treg的结 ...

这句话我读了好几次，愣是没读懂。你这里的问题关键就在于电压和补偿。

丰登

好的。抱歉。其实就想说：反正不分析PE和FITC，那我就不用调节PE和FITC的补偿。我只要APC和PE的结果，只要这两个补偿没问题不就ok？

niwanmao

丰登 发表于 2016-1-25 21:56
好的。抱歉。其实就想说：反正不分析PE和FITC，那我就不用调节PE和FITC的补偿。我只要APC和PE的结果，只要 ...

不分析PE？你的foxP3不是PE标记的吗？当然要调节PE和FITC的补偿