关于全血如何测表面因子？急急急急

mcdfish

各位高手：
       我的实验设计是这样的：将动物体内刺激抗原，每周体外采血后刺激病原（二次刺激），约20h后，收集血浆测细胞因子，测外周血单个核细胞的各种细胞变化（诸如CD3/CD4/CD8/CD21等）。
       但是问题来了，怎么染表面因子？是直接破红细胞，然后离心染色吗？这样会不会破坏细胞表型，影响结果？
       以前是把PBMC分离以后收细胞上清，然后收集细胞染色。但是要将每头动物的血分离（每头动物都要分开），再计数调整细胞数，这样的结果感觉不是很好。我总结原因可能主要是多方面原因造成了很大影响：1是本身动物场地较远，基本8小时才能到达实验室，再加上动物头数较多，要分别分离，最少也要4-5个小时，操作时间太长，影响细胞活力；2是每头动物计数要蛮长时间，计数也不是特别准确。我基本上都是计算两头动物的数量然后按照这个数铺板子。我感觉计数不准确，只能说数量级差不多，但是细胞多肯定产生的细胞因子多些，对结果影响较大。因此，我就考虑尽量少动细胞，全血中的细胞量肯定是差不多的，因此想能否用全血直接二次刺激？还请各位高手不吝赐教！！小妹先谢过了。

niwanmao

还不是很清楚你要问的问题。
你是指如何检测CD3、CD4、CD8、CD21还是血浆的细胞因子？
如果是前者，只需收集后标记抗体，再裂解红细胞，最后离心去上清上机即可。
如果是后者，需要用微球包被的相关细胞因子抗体检测。

mcdfish

麻烦帮帮我，真的很苦恼。

mcdfish

niwanmao 发表于 2016-2-15 12:05
还不是很清楚你要问的问题。
你是指如何检测CD3、CD4、CD8、CD21还是血浆的细胞因子？
如果是前者，只需收 ...

我要检测全血中的PBMC中的CD3、CD4、CD8、CD21，您意思是说先拿标记的抗体孵育，再裂解红细胞？我本来以为是先裂解红细胞，再标记抗体的。那需要多少全血进行标记？一般分离PBMC后的染色是100ul（10的6次方），但全血中100ul估计只有10的5次方，破红以后就没有多少细胞了吧？

niwanmao

mcdfish 发表于 2016-2-16 10:35
我要检测全血中的PBMC中的CD3、CD4、CD8、CD21，您意思是说先拿标记的抗体孵育，再裂解红细胞？我本来以 ...

足够用了。

mcdfish

niwanmao 发表于 2016-2-16 18:22
足够用了。

倪老师，谢谢您的指导 。想问下你先染色后裂解细胞与先裂解后染色有区别吗？我之前先分离PBMC，然后用低渗的氯化钠残留的破红细胞，结果PBMC的数量少了很多，裂解红细胞对表面标识的检测影响大吗？

niwanmao

mcdfish 发表于 2016-2-18 16:17
倪老师，谢谢您的指导 。想问下你先染色后裂解细胞与先裂解后染色有区别吗？我之前先分离PBMC，然后用低 ...

先裂解红细胞后染色是否对表面标记有影响，一定要进行对比才能确定，只能说有些标记会受影响。但目前表面标记共识都是先染色，再裂解。

mcdfish

niwanmao 发表于 2016-2-18 18:50
先裂解红细胞后染色是否对表面标记有影响，一定要进行对比才能确定，只能说有些标记会受影响。但目前表面 ...

好的，谢谢倪老师，如果有详细步骤，能否发给我参考下？还有裂解液什么品牌好些？

niwanmao

mcdfish 发表于 2016-2-18 19:58
好的，谢谢倪老师，如果有详细步骤，能否发给我参考下？还有裂解液什么品牌好些？ ...

抗体＋标本孵育15分钟，然后裂解10分钟，离心去上清，加PBS重悬，就这么简单。
裂解液可以自己配制氯化铵裂解液（配方站内有）。

mcdfish

niwanmao 发表于 2016-2-18 20:11
抗体＋标本孵育15分钟，然后裂解10分钟，离心去上清，加PBS重悬，就这么简单。
裂解液可以自己配制氯化铵 ...

好的，谢谢。您一般是常温孵育还是冰上孵育？