荧光补偿遇到的问题

小橘灯

求问，在做MDSC中，用到LIN-FITC的抗体（有CD3 ，CD14，CD19，CD16，CD56),染外周血，裂红，上机分析。大家知道，调补偿，是根据单阳管，把溢漏到其他通道的荧光给减去。但是调补偿的过程中，由于FITC分好几个群，而且阴性群部分很少，所以阴性对照那部分不明显，不太好调遇到这个问题该怎么办呢？是吧最高强度的FITC和阴性调在一起？能用调荧光补偿的微球来调吗？那还有如果用微球来调的话，不同的细胞结合的抗体不同，FITC的强度也不同，用微球来调，可以把不同荧光强度的溢漏都调为0吗？

补充问题：图1中，淋巴，单核，粒还算分的比较明显，但是上面多出来两群，左边多出来的一群应该是嗜酸，因为（1），它在FSC和SSC的图上，出现的位置是SSC比较高的地方，颗粒度比较强。（2）当外周血什么抗体都不加时，它经常出现在荧光图的对角线位置，会有非特异性荧光。右边多出来的那群是什么，是粒细胞的粘连细胞吗？在图4中它和粒细胞出现在同一位置，但其lin的荧光强度会比粒细胞高

niwanmao

小橘灯 发表于 2016-3-10 23:30
谢谢倪老师您的分析。
淡绿色的细胞，它只要不染抗体，都出现在荧光通道的对角线位置，我们有染CD33和CD1 ...

那不叫染上，而是非特异性结合。可以这么比喻吧，活细胞是一个正常的人，只会和他觉得友好的人接触（抗原和抗体结合），而活性差或死细胞就类似于彻底放弃了自我的人，自暴自弃，来什么就结合什么，没有选择性，所以你会看到什么标记都是阳性的。

不过你这里这两类细胞也不排除是粘连体的可能，切换到FSC-A/FSC-W看看。

niwanmao

蓝色和淡绿色都是活性差的细胞或死细胞，我建议排除，不要圈。如果你在其中加入一个细胞死活鉴别染料，这些细胞就可能被排除掉。
调节补偿最好用细胞调，微球可以调节大概的值，最后的精确调节还是需要细胞。

小橘灯

niwanmao 发表于 2016-3-7 21:13
蓝色和淡绿色都是活性差的细胞或死细胞，我建议排除，不要圈。如果你在其中加入一个细胞死活鉴别染料，这些 ...

谢谢倪老师您的分析。
淡绿色的细胞，它只要不染抗体，都出现在荧光通道的对角线位置，我们有染CD33和CD11b，淡绿色的细胞可以染上，我们分析这群是嗜酸粒细胞。但是即使是嗜酸粒细胞，确实要依照您的建议，不要圈，因为圈上会影响分析的比例。
蓝色的那群，我没有经验，确实不清楚，倪老师，活性差的细胞是容易粘连吗，所以他们出现在FSC和SSC都很高的位置，所以荧光强度也都很高？可以这样解释吗？
倪老师，我们没有买死活鉴别染料，但是实验室有PI，它和DNA的结合物激发波长为535nm,我们实验室是CANTO，双激光，488,638，能用PI来鉴别吗？