请教多重染色时的补偿调整问题

shinian

最近做T细胞的流式染色，遇到一个关于补偿调整的问题，向大家请教一下。

我的多重染色当中，需要同时用到CD8-PE和CD45RA-PerCpCy5.5，通过单染的样品管检测可以发现，PE通道对PerCP通道干扰比较强，需要调整补偿值。但是调整补偿之后，在检测多重染色样品时发现，CD45RA-PerCpCy5.5的阳性比率严重偏低了。

图一，CD45RA-PerCpCy5.5单染，这个图可以看出待测样品CD45RA-PerCpCy5.5阳性比率应该是70%左右。此管样品是单染，无其他通道干扰，那么这个值应该是反应了CD45RA-PerCpCy5.5的真实表达水平。

CD45RA-PerCpCy5.5 单染

图二，三，CD8-PE单染，调整补偿值，使PerCp通道信号为阴性。

CD80-PE 单染

CD80-PE单染 PE PerCpCy5.5

图四，调整补偿值之后，检测多重染色样品，PerCP通道信号阳性比率变成26%，明显比CD45RA-PerCpCy5.5单染管要低很多。很多信号落在了坐标轴最左的位置。

多重染色 CD45RA-PerCpCy5.5

现在我的问题是，按照标准流程调整了补偿值，结果导致了PerCpCy5.5通道信号明显低于真实水平，这种情况该怎么处理呢？

niwanmao

补偿调节的标准你弄错了，请参考《为什么会存在荧光补偿？如何调节？看图！》（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4768-1-1.html）

shinian

niwanmao 发表于 2016-3-21 12:18
补偿调节的标准你弄错了，请参考《为什么会存在荧光补偿？如何调节？看图！》（http://www.flowcyto.cn/bbs ...

看了参考帖子，和我理解的补偿调节是一样的啊

niwanmao

shinian 发表于 2016-3-21 13:41
看了参考帖子，和我理解的补偿调节是一样的啊

调节补偿用的是否为同一群细胞？标本是否有粒细胞、单核细胞？

shinian

niwanmao 发表于 2016-3-21 14:17
调节补偿用的是否为同一群细胞？标本是否有粒细胞、单核细胞？

完全相同的细胞，是PBMC培养的CIK

shinian

补偿值调节的过程拍了一组照片

shinian

补偿值调节的过程拍了一组照片

家的感觉

阴性细胞群怎么感觉都压到线外面了，空白细胞样本阴性群应该好着呢吧

shinian

家的感觉 发表于 2016-3-21 15:18
阴性细胞群怎么感觉都压到线外面了，空白细胞样本阴性群应该好着呢吧

我也觉得补偿之后阴性细胞群都到了坐标轴最左边之外这样不正常。但是你可以看我上面调整补偿值过程的图片，补偿值不够高的时候PE单染细胞有很大部分处在PerCp阳性，逐渐调高补偿值就导致很多细胞被压倒坐标轴外。不知道这个补偿值该调到哪里合适了

家的感觉

shinian 发表于 2016-3-21 15:49
我也觉得补偿之后阴性细胞群都到了坐标轴最左边之外这样不正常。但是你可以看我上面调整补偿值过程的图片 ...

就是呀，左下角百分之十八九的比例应该是明显的群，不只是不是软件设置问题，总感觉不大正常